NY/T 919-2020 饲料中苯并（a）芘的测定
前言
本标准按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。
本标准代替NY/T 919-2004《饲料中苯并（a）芘的测定 高效液相色谱法》。与NY/T 919-2004
相比，除编辑性修改外主要内容差异如下：
——修改了标准名称；
——修改了方法的适用范围（见第1章，2004年版的第1章）；
——修改了液相色谱法的检出限（见第1章，2004年版的第1章）；
——增加了液相色谱方法的定量限（见第1章，2004年版的第1章）；
——增加了液相色谱串联质谱法（见第3章）；
——修改了高效液相色谱法的试验步骤（见4.5，2004年版的第7章）；
——修改了高效液相色谱法的试验数据处理（见4. 6，2004年版的第8章）。
请注意本文件的某些内容可能涉及专li。本文件的发布机构不承担识别这些专li的责任。
本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）归口。
本标准起草单位：山东新希望六和集团有限公司、中国饲料工业协会、广东省农业科学院农产品公共监测中心。
本标准主要起草人：杨青、王黎文、郭吉原、孔凡科、王威利、周桂莲、孙春华、姜晓霞，郭丽君。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
——NY/T 919-2004。
1范围
本标准规定了饲料中苯并（a）芘测定的液相色谱-串联质谱法和高效液相色谱法。
本标准中液相色谱串联质谱法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和饲料原料（硅铝酸盐等具有吸附性的矿物质饲料原料和油脂除外）中苯并（a）芘的测定，检出限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。
本标准中高效液相色谱法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中苯并（a）芘的测定，检出限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不ke少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和武验方法
GB/T 20195动物饲料 试样的制备
3 液相色谱-串联质谱法
3.1原理
试样中的苯并（a）芘经正己烷丙酮溶液提取后用固相萃取柱净化，经洗脱、浓缩、复溶后，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。
3.2试剂或材料
警告：苯并（a）芘是一种已知致癌物，标准物质使用中应特别注意安全防护，测定应在通风柜中进行并戴手套，尽量减少暴露，如已污染了皮肤，应采用10%次氯酸钠水溶液浸泡和洗刷，在紫外光下观察皮肤上有无蓝紫色斑点，一直洗到蓝紫色斑点消失为止。
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
3.2.1水：GB/T 6682，一级，
3.2.2乙腈：色谱纯。
3.2.3正己烷。
3.2.4正己烷丙酮混合溶液，取850 mL正己烷（3.2.3），加入150 mL丙酮，混匀。
3.2.5苯并（a）芘标准储备溶液（100μg/mL）：准确称取10mg（精确至0.01mg）苯并（a）芘标准品（CAS号：50-32-8，纯度≥97%），用乙腈（3.2.2）溶解转移至100ml容量瓶中，定容，摇匀。于0℃~4℃保存，有效期6个月。也可使用市售有证标准储备溶液。
3.2.6苯并（a）芘标准中间溶液I （5.00μg/mL）：准确移取苯并（a）芘标准储备溶液（3.2.5）5mL于100 mL容量瓶中，用乙腈（3.2.2）定容，摇匀。临用现配。
3.2.7苯并（a）芘标准中间溶液II （500μg/L）：准确移取苯并（a）芘标准中间溶液I （3.2.6）5mL于50mL容量瓶中，用乙腈（3.2.2）定容，摇匀。临用现配。
3.2.8 氘代苯并（a）芘标准储备溶液（100μg/ mL）：准确称取10 mg（精确至0. 01 mg）氘灯苯并（a）芘标准品[苯并（a）芘-DI2，CAS号：63466-71-7，纯度≥97%]，用乙睛（3.2.2）溶解转移至100mL， 容量瓶中，定容，摇匀。于0℃~4℃保存，有效期为6个月。也可使用市售有证标准储备溶液。
3.2.9氘代苯并（a）芘标准中间溶液（1.00μg/mL）：准确移取氘代苯并（a）芘标准储备溶液（3.2.8）1mL于100 mL容量瓶中，用乙睛（3.2.2）定容，摇匀。临用现配。
3.2.10氘化苯并（a）芘标准工作溶液（200μg/L）：准确移取氘代苯并（a）芘标准中间溶液（3.2. 9）10 mL于50 mL容量瓶中，用乙腈（3.2.2）定容，摇匀。临用现配。
3.2.11苯并（a）芘混合标准系列溶液：准确移取苯并（a）芘标准中间溶液ll （3.2.7）0μL、100μL、200μL、500μL、1000μL、2000μL，分别置于10mL容量瓶中，再向每个容量瓶中加入氘代苯并（a）芘标准工作溶液（3.2.10）500μL，用乙腈（3.2.2）定容，摇匀。配制成苯并（a）芘浓度分别为0 μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L的混合标准系列工作溶液，内标浓度为10. 0μg/L。
3.2. 12固相萃取柱：中性氧化铝，粒径75μm~ 150μm，22 g/60 mL（苯并芘专用柱）。
注：空气中水分对其性能影响很大，打开固相萃取柱包装后应立即使用或密闭避光保存。由于不同品牌氧化铝活性存在差异，建议对质控样品进行测试，或做加标回收试验，验证氧化铝活性满足要求。
3.2. 13微孔滤膜：0.22μm，有机系。
3.3仪器设备
3.3. 1液相色谱-串联质谱仪：配有大气压化学电离源（APCI）。
3.3.2分析天平：感量为 1 mg和0.01 mg。
3.3.3索氏抽提装置。
3.3.4水浴锅：温控（85±2）℃。
3.3.5旋转蒸发仪：温控（40±0. 5）℃。
3.3.6固相萃取装置。
3.3.7氮吹仪。
3.3.8涡旋振荡器。
3.3.9茄形瓶：250 mL。
3.4 样品
按GB/T 20195制备样品，至少200g，粉碎使其全部通过0.42mm孔径的分析筛，充分混匀，装入磨口玻璃瓶中，备用。
3.5试验步骤
3.5.1 提取
平行做2份试验。称取试样约10 g，精确至1 mg，置于滤纸包中，加入氘代苯并（a）芘标准工作溶液（3.2. 10）100μL。将滤纸包置于索氏抽提器内，在烧瓶中加入约2/3 体积的正己烷丙酮混合溶液（3. 2.4），85℃抽提6 h，回流速度不低于每小时4次。取下烧瓶，40℃旋蒸至近干。加入10 mL正己烷溶解残渣，得到待净化液，备用。
3.5.2净化
用30mL固相萃取柱（3.2.12），待液面降至柱床时，关闭底部旋塞。将待净化液（3.5.1）转移进净化柱，打开旋塞，以约1mL/min的速度过柱，收集净化液于茄形瓶（3.3.9）中，再用80mL正己烷继续洗脱，收集并合并净化液。将净化液于40℃下旋蒸至近干。用正己烷清洗茄形瓶，每次2 mL，重复2次~3次，合并洗涤液至试管中，于40℃下氮气吹干。残渣中准确加入乙腈（3.2.2）2.0 mL，涡旋30 s复溶，微孔滤膜（3.2.13）过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。
3.5.3液相色谱-串联质谱仪参考条件
3.5.3.1液相色谱参考条件
色谱柱：C18柱，柱长100 mm，内径2.1 mm，粒度2.5μm，或性能相当者。
流动相：乙腈+水=75+25。
流速：0.45 mL/min。
柱温：30℃。
进样量：10 μl。
3.5.3.2质谱参考条件
离子源：大气压化学电离源（APCI）。
检测方式：多反应监测（MRM） ，正离子模式。
放电电流：1.5μA。
脱溶剂气：1 000L/h。
锥孔气流量：150 L/h。
脱溶剂气温度：400℃。
源温度： 150℃。
监测离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值见表1。
3.5.4 测定
3.5.4.1混合标准系列溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液（3.2.11）和试样溶液（3.5.2）上机测定。苯并（a）芘标准溶液的监测离子色谱图參见附录A中的图A.1。
3.5.4.2 定性
在相同试验条件下，试样溶液与混合标准系列溶液中苯并（a）芘的保留时间相对偏差应在±2.5%之内。根据表1选择的定性离子对，比较试样谱图中苯并（a）芘定性离子的相对离子丰度与浓度接近的混合标准系列溶液中对应的定性离子的相对离子丰度，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在苯并（a）芘。
3.5.4.3 定量
以苯并（a）芘的浓度为横坐标、苯并（a）芘与氘代苯并（a）芘的峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于0. 99。试样溶液与标准溶液中苯并（a）芘的响应值均应在标准曲线线性范围内，如超出范围，应重新试验。
3.6试验数据处理
试样中苯并（a）芘的含量以质量分数ω计，数值以微克每千克（μg/ kg）表示，多点校准按式（1）计算。
式中：
ρ——由标准曲线得到的试样溶液中苯并（a）芘的浓度，单位为微克每升（μg/L） ；
V——氮气吹 干后乙腈复溶液的体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）。
测定结果以平行测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
3.7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。
4 高效液相色谱法
4.1原理
试样中的苯并（a）芘经正己烷丙酮溶液提取后，用固相萃取柱净化，经洗脱、浓缩、复溶后，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。
4.2试剂或材料
警告：苯并（a）芘是一种已知致癌物，标准物质使用中应特别注意安全防护。测定应在通风柜中进行并戴手套，尽量减少暴露。如已污染了皮肤，应采用10%次氯酸钠水溶液浸泡和洗刷，在紫外光下观察皮肤上有无蓝紫色斑点，一直洗到蓝紫色斑点消失为上。
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
4.2.1 水：GB/T 6682，二级。
4.2.2乙腈：色谱纯。
4.2.3正己烷。
4.2.4正己烷丙酮混合溶液：取80mL正己烷，加入150 mL丙酮，混匀。
4.2.5苯并（a）芘标准储备溶液（100μg/mL）：同3.2.5。
4.2.6苯并（a）芘标准中间溶液I（5.00μg /mL）同3.2.6。
4.2.7苯并（a）芘标准中中间溶液II（500μg /mL）同3.2.7。
4.2.8苯并（a）芘标准系列液：准确移取苯并（a）芘标准工作溶液（4.2.7）0μL、100μL、200μL、500μL、1000μL、2000μL分别置于10ml容量瓶中用乙腈（4.2.2）定容，摇匀，配制成装苯并（a）芘浓度分别为0μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L的标准系列工作溶液。
4.2.9固相萃取柱：同3. 2.12。
4.2.10微孔法膜： 0.45μm，有机系。
4.3仪器设备
4.3. 1高效液相色谱仪：配有荧光检测器。
4.3.2分析天平：感量为1mg 和0.01 mg。
4.3.3索氏抽提装置。
4.3.4水浴锅： 温控（85±2）℃。
4.3.5旋转蒸发仪：温控（40±0.5）℃。
4.3.6固相萃取装置。
4.3.7氮吹仪。
4.3. 8涡旋振荡器。
4.3.9茄形瓶：250 mL。
4.4 样品
同3.4。
4.5试验步骤
4.5.1 提取
平行做2份试验。除不加氘代苯并（a）芘标准工作溶液外，同3.5.1。
4.5.2净化
同3.5.2。
4.5.3液相色谱参考条件
色谱柱：C18柱，柱长150 mm，内径4.6 mm，粒度5μm，或性能相当者。
流动相：乙腈+水=75+25。
流速：1. 0 mL/min。
柱温：40℃。
进样量：20μL。
荧光检测器：激发波长379nm，发射波长405nm。
4.5.4 测定
4.5.4. 1标准系列溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液（4.2.8）和试样溶液（4.5.2）上机测定。苯并（a）芘标准溶液的液相色谱图参见A.2。
4.5.4.2定性
以保留时间定性，试样溶液中苯并（a）芘的保留时间应与标准系列溶液中苯并（a）芘的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。
4.5.4.3 定量
以苯并（a）芘的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中苯并（a）芘的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试样溶液用乙腈稀释后，重新测定。
4.6试验数据处理
试样中苯并（a）芘的含量以质量分数ω计，数值以微克每千克（μg/kg）表示，多点校准按式（2）计算。
式中：
ρ——由标准曲线得到的试样溶液中苯并（a）芘的质量浓度，单位为微克每升（μg/L）；
V——氮气吹干后乙腈复溶液的体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）。
测定结果以平行测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
4.7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。
