NY/T 1756-2012 饲料中孔雀石绿的测定
高效液相色谱法
前言
本标准按照GB/T 1. 1给出的规则起草。
本标准代替NY/T 1756-2009 《饲料中孔雀石绿的测定》。
本标准与NY/T 1756-2009的主要差异如下：
——在适用范围中增加了“植物性饲料原料"和“精料补充料"；
——液相色谱-串联质谱部分增加了进样前离心步骤；
——标准对6.2. 12溶液浓度做了详细说明。
本标准由农业部畜牧业司提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）归口。
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心（北京）]、浙江省饲料监察所。
本标准主要起草人：李兰、索德成、贾铮、应永飞、杨曙明、朱聪英、赵根龙、魏书林、肖志明、杜洪鸽、孙志文、符金华。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
——NY/ T 1756-2009。
1范围
本标准规定了用液相色谱仪和液相色谱-串联质谱仪测定饲料中的孔雀石绿及其同系物无色孔雀石绿含量的方法。
本标准分为高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法，高效液相色谱-串联质谱法为确证法。
本标准高效液相色谱法适用于鱼粉、配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、精料补充料中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定；高效液相色谱-串联质谱法适用于鱼粉、植物性饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、精料补充料中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定。
液相色谱法测定孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为10μg/ kg；液相色谱-串联质谱法测定孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为1. 0μg/ kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不ke少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1饲料 采样
GB/T 20195动物饲料 试样的制备
3采样
按GB/T 14699. 1的规定执行。
4试样的制备
选取有代表性饲料样品，按GB/T 20195制备样品，过0. 425 mm（40目）孔筛。
5液相色谱法
5.1 原理
以乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过二氯甲烷液液萃取，再经固相萃取柱净化，用接有二氧化铅柱的氰基柱进行高效液相色谱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。
5.2试剂
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一-级用水。
5.2. 1乙腈：色谱纯。
5.2.2二氯甲烷。
5.2.3盐酸羟胺溶液：称取12.5g盐酸羟胺溶于50mL水中。
5.2. 4盐酸羟胺甲醇溶液：取1 mL盐酸羟胺溶液（5.2.3）加甲醇定容至100 mL。
5.2.5乙酸钠缓冲溶液：称取4.95g无水乙酸钠和0.95g对甲苯磺酸于900mL水中，用冰乙酸调节pH4.5，用水定容至1 000 mL。
5.2.6 1.0mol/L对甲苯磺酸溶液：称取17.2g对甲苯磺酸，加水溶解并定容至100mL。
5.2.7中性氧化铝，粒度为0. 071 nm~0. 1501nm，层析用。
5.2.8乙腈-乙酸钠缓冲溶液：乙腈+乙酸钠缓冲溶液（5.2. 5）= 60+40。
5.2.9氯化钠溶液：称取25 g氯化钠，加水溶解并定容至500 mL。
5.2.10孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取孔雀石绿标准品（纯度≥95%）0.1000g，用乙腈（5.2.1）溶解并定容至100 mL。该溶液中孔雀石绿的浓度为1 mg/ mL，于-18℃保存可使用3个月。
5.2.11无色孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取无色孔雀石绿（纯度≥95%）0.1000g，用乙腈（5.2.1）溶解并定容至100 mL。该溶液中无色孔雀石绿浓度为1 mg/ mL，于-18℃保存可使用3个月。
5.2.12孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液：精确移取孔雀石绿标准贮备溶液（5.2.10）和无色孔雀石绿标准贮备溶液（5.2.11）各5mL，置于50mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为10μg/ mL，于2℃~8℃保存可使用1个月。
5.2.13孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液。精确移取孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液
（5.2.12）各1 mL，置于100ml棕色容量瓶中，用乙脂乙酸钠缓冲溶液（5.2.8）定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀有绿均为100 ng/mL，现用现配。
5.3仪器与设备售
5.3. 1高效液相色谱仪配紫外可见光松测器
5.3.2电子天平：感量0.0001 g、感量0.001g。
5.3.3离心机。
5.3.4振荡器。
5.3.5旋转蒸发器可控温25℃~40℃。
5.3.6中性氧化铝柱： 1g/6mL。
5.3.7丙基磺酸阳离子树脂PRS （propylsulfonic acid）柱：500mg/3mL。
5.4分析步骤
5.4.1 提取
称取试样约5 g（精确到0.001g），置于100mL离心管中，依次加入1.5mL盐酸羟胺溶液（5.2.3）、2 mI对甲苯磺酸溶液（5.2.6）、5 mL乙酸钠缓冲溶液（5.2.5）和20ml乙腈，加入约2 g中性氧化铝（5.2.7），振荡2 min，超声30 min，4000r/min离心5min，将上清液转移至250mL分液漏斗中，向离心管中再次加入20mL乙腈，振摇2 min，4000r/min离心5 min，合并上清液至分液漏斗中。
5.4.2液液萃取
加入 50 mL氯化钠溶液（5.2. 9）、50mL二氯甲烷（5.2.2），旋摇，静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后，在分液漏斗再次加入20 mL二氯甲烷，旋摇，静置分层，收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35℃下减压旋转蒸发（注意：开始时温度不要直接升到35℃，以免冲料损失）至近干，加入5 mL乙腈溶解残渣，备用。
5.4.3固相萃取净化
将中性氧化铝柱（5.3.6）串接在PRS柱（5.3.7）上方，使用前用5 mL乙腈预洗两柱。将5.4.2的样液缓慢转移到中性氧化铝柱内，在抽真空情况下过柱（保持流速1 mL/ min）。再用5 mL乙腈洗涤蒸发瓶2次，洗涤液均转移至柱内，最后用5mL乙腈洗涤小柱。
弃去中性氧化铝柱，用乙腈-乙酸钠缓冲溶液（5.2.8）2 mL、盐酸羟胺甲醇溶液（5.2.4）1 mL洗脱，收集洗脱液，过0. 45μm微孔滤膜上机测定。
5.4.4 测定
5.4.4.1 液相色谱参考条件
色谱柱：氰基柱，柱长250mm，内径4.6mm；柱后串接氧化铅柱，柱长35mm，内径4.6mm。
流动相：乙腈+乙酸钠缓冲溶液= 60+40。
流速：1.0 mL/ min。
柱温：室温。
进样量：50μL。
检测波长：600 nm。
5.4.4.2定量测定
调整仪器工作参数，使其处于良好状态。向液相色谱仪中注入孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液（5.2.13）及试样溶液（5.4.3） ，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。
5.4.4.3结果计算
试样中孔雀石绿或无色孔雀石绿的含量Xi ，以质量分数表示，单位为微克每千克（μg/kg） ，按式（1）计算。
式中：
Pi——试样溶液峰面积值；
V——样品的总稀释体积，单位为是毫升（mL）；
Vst——标准工作溶液的进样体积，单位为毫升（mL）；
Vi——样品溶液的进样体积，单位为毫升（mL）；
Ci——标准工作溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
Pst——标准工作溶液峰面积平的值；
m——试样质量，单位为克（g）。
5.4.4.4结果表示
平行测定结果用算术平均值表示，保留二位有效数字。
5.5重复性
重复性条件下，平行测定结果的相对偏差不大于15%。
6液相色谱-串联质谱法
6.1 原理
以乙腈提取样晶中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过固相萃取柱净化后，进行液相色谱-串联质谱仪测定，以内标法定量。
6.2试剂
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分柿纯的试剂和符合GB/ T 6682规定的一级用水。
6.2.1乙腈：色谱纯。
6.2.2甲醇：色谱纯。
6.2.3中性氧化铝：粒度为0. 071 nm~0.1501nm，层析用。
6.2.4 甲酸：优级纯。
6.2.5甲酸溶液：0.1% ，取甲酸（6.2.4）1.0 mL加水定容至1 000 mL。
6.2.6 淋洗液：取甲酸溶液（6.2.5）20 mL，加乙腈定容至100 mL。
6.2.7洗脱液 ：取氨水5 mL加甲醇至100 mL，摇匀。
6.2.8标准贮备溶液：准确称取孔雀石绿标准品（纯度≥95%）、无色孔雀石绿标准品（纯度≥95%）、氘代孔雀石绿标准品（纯度≥95%）、氘代无色孔雀石绿标准品（纯度≥95%），用乙腈分别配制成100μg/mL的标准贮备液，-18℃避光保存备用，可使用3个月。
6.2.9混合标准贮备溶液：分别吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准贮备溶液（6.2.8） ，用乙腈稀释成1μg/mL，-18℃避光保存，可使用1个月。
6.2.10混合内标贮备溶液：分别吸取氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿标准贮备溶液（6.2.8），用乙腈稀释成1μg/ mL， -18℃避光保存，可使用1个月。
6.2.11混合内标工作溶液：用乙腈稀释内标贮备溶液（6.2.10） ，配制成含氘灯孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿各100 ng/mL的混合内标工作溶液，-18℃避光保存，可使用1个月。
6.2.12混合标准工作溶液：根据需要，临用时用流动相稀释混合标准贮备溶液（6.2.9）和混合内标贮备溶液（6.2.10） ，配制成适当浓度的混合标准工作溶液，每毫升混合标准工作溶液含有氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿的量应与样品含量相同。
6.3仪器与设备
6.3.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾（ESI）离子源。
6.3.2电子天平：感量0.0001 g、感量0.001 g。
6.3.3离心机。
6.3.4 振荡器。
6.3.5旋转蒸发器，可控温35℃~60℃。
6.3.6 固相萃取装置。
6.3.7中性氧化铝柱：1 g/ 6mL。
6.3.8丙基磺酸阳离子树脂PRS （propylsulfonic acid）柱： 500 mg/3 mL。
6.4分析步骤
6.4.1试样提取
称取试样约5g（精确到0.001 g），置于50mL离心管中，依次加入200μL混合内标工作液（6.2.11）、约2g中性氧化铝（6.2.3）、20mL乙腈，涡旋混匀，超声30min；于8000r/min离心10min，倾出上清液至旋转蒸发瓶中，另取20 mL乙腈重复提取一次， 合并上清液；在35℃下减压蒸至近干，用5mL乙腈溶解残渣，备用。
6.4.2试样净化
将中性氧化铝柱（6.3.7）串接在PRS柱（6.3.8）上方，用5 mL乙腈活化。取试液（6.4.1）过柱，另取5mL乙腈清洗旋转蒸发瓶，溶液过柱，重复以上操作一次，取5mL乙腈淋洗柱子。移去中性氧化铝柱，用5 mL淋洗液（6.2.6）淋洗阳离子交换柱，弃去流出液，抽干；用5 mL洗脱液（6.2.7）洗脱。收集洗脱液，用氮气在50℃吹至近干，用流动相（6.4.3）溶解残渣，并定容到适当的体积、离心，取上层清液过0.22μm滤膜过滤后上机测定。
6. 4.3液相色谱参考条件
色谱柱：C18柱：柱长150 mm，内径2. 1 mm，填料粒度3. 5μm；或性能相当的色谱柱。
流动相：0.1%甲酸溶液（6.2. 5）+乙腈（6.2.1）=22+78。
流速：0.25 mL/min。
柱温：50℃。
进样量：20μL。
6.4.4质谱参考条件
离子源：电喷雾ESI离子源。
扫描方式：正离子扫描。
检测方式：多反应监测。
监测离子对及电压参考见表1。
6.4.5定性测定
每种被测组分选择1个母离子、2个子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准工作液中相对保留时间偏差在±2.5%之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的对照品工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。如有可能，可利用基质添加实验确证结果。
6.4.6 定量测定
在仪器正常工作条件下，对混合标准工作溶液进样，以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐标，被测组分浓度为横坐标，用内标法对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。以氘代孔雀石绿为内标物计算孔雀石绿含量，以氘代无色孔雀石绿为内标物计算无色孔雀石绿含量。上述色谱和质谱条件下，孔雀石绿、无色孔雀石绿以及内标物氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿标准物质的多反应监测色谱图参见附录A。
6.5结果计算
试样中孔雀石绿或无色孔雀石绿的含量Xi，以质量分数表示，单位为微克每千克（μg/ kg） ，按式（2）计算：
式中：
C——孔雀石 绿或无色孔雀石绿标准工作溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ mL） ；
Csi——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ mL）； .
Ci——样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ mL）；
P——样液中孔雀石绿或无色孔雀石绿的峰面积；
Ps——孔雀石绿或无色孔雀石绿标准工作溶液的峰面积；
Psi——标准工作溶液中内标物的峰面积；
Pi——样液中内标物的峰面积；
6.6结果表示
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
6.7重复性
重复性条件下，平行测定结果的相对偏差不大于20%。
