GB 29682-2013 食品安全国家标准
水产品中青霉素类药物多残留的测定
高效液相色谱法
1范围
本标准规定了水产品中4种青霉素类药物残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。
本标准适用于鱼可食性组织中青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素单个或多个药物残留量的检测。
2规范性引用文件
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试料中残留的青霉素类药物，用乙腈提取，HLB柱净化，1，2，4-三氮唑和氯hua汞溶液衍生，高效液相色谱-紫外测定，外标法定量。
4试剂与材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水应符合GB/T6682规定的一级水。
4.1青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准品：含量≥98%。
4.2甲醇。
4.3乙腈。
4.4五水硫代硫酸钠。
4.5二水磷酸二氢钠 。
4.6无水磷酸氢二钠。
4.7硫酸铵。
4.8氢氧化钠。
4.9正己烷。
4.10 1，2，4-三氮唑 。
4.11氯hua汞（Ⅱ）。
4.12 HLB固相萃取柱：60mg/3mL，或相当者。
4.13流动相A：取五水硫代硫酸钠3.9 g，用水溶解，再加入二水磷酸二氢钠10.2 g、无水磷酸氢二钠4.9 g、硫酸铵6.8 g，用水溶解，并稀释至1 000 mL，滤膜过滤。
4.14氯hua汞（Ⅱ）溶液：取氯hua汞（Ⅱ ）0.27 g，用水溶解并稀释至10 mL，现配现用。
4.15 5mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠20 g，用水溶解并稀释至100 mL。
4.16衍生化试剂：取1，2，4-三氮唑13.78 g，用水60 mL溶解，加氯hua汞溶液10 mL，用5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水稀释到100 mL。2 ℃~8℃避光保存，有效期3个月。
4.17 1mg/mL青霉素类药物标准贮备液：精密称取青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素的标准品各10 mg，分别于10 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的青霉索G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准贮备液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
4.18 10μg/mL青霉素G标准工作液：精密量取1 mg/mL青霉素G标准贮备液1.0 mL，于100 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL的青霉素G标准工作液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
4.19 10μg/mL苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素混合标准工作液：精密量取1 mg/mL苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准贮备液各1.0mL，于100mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL的苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉索混合标准工作液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。
5.2分析天平：感量0.00001 g。
5.3 天平：感量0.01g。
5.4冷冻高速离心机。
5.5恒温水浴锅。
5.6 旋涡混合器。
5.7固相萃取装置。
5.8组织匀浆机。
5.9氮气吹干装置。
5.10离心管：50 mL。
5.11滤膜：0.45μm。
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
鱼去鳞、去皮，沿背部取肌肉组织，或取鱼肌肉+皮组织，绞碎，并使均质。
——取均质后的供试样品，作为供试试料。
——取均质后的空白样品，作为空白试料。
——取均质后的空白祥品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-20℃以下保存。
7测定步骤
7.1标准曲线的制备
分别精密量取10μg/mL青霉素G标准工作液及10μg/mL苯唑西林、双氨青霉素和乙氧萘青霉家混合标准工作液适量，用流动相稀释，配制成青霉素G浓度为20、50、100、200、400、800和1600μg/，苯唑西林双氯青霉素和乙氧萘青霉素浓度为100、200、400、800、1600、3200和6400μg/L的系列青霉素类药物混合标准溶液，各取500μL，按衍生化步骤操作，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
7.2 提取
称取试料5 g±0.05 g，于50 mL离心管中，加乙腈15 mL，混匀，加正己烷5 mL，旋涡混匀，6000 r/min离心15 min，弃正已烷层液，取下层液，于另一离心管中。残渣中再加乙腈10 mL、正已烷5 mL，旋涡混匀，6 000 r/min离心15 min，弃正己烷层液，合并两次下层液，于40℃水浴旋转蒸干，用水5mL溶解残余物，备用。
7.3净化
HLB柱依次用甲醇3 mL和水3 mL活化，取备用液过柱，用水1 mL淋洗，乙腈3 mL洗脱，收集洗脱液，于45℃~50℃水浴氮气吹干。用流动相1.0 mL溶解残余物，旋涡混匀，备用。
7.4衍生化
准确量取备用液500μL，于1.5mL聚丙烯离心管中，加衍生化试剂500μL，旋涡混匀，于65℃水浴反应10 min，快速冰浴冷却，于4℃ 10000 r/min离心10 min，取上清液，供高效液相色谱测定。
7.5 测定
7.5.1色谱条件
7.5.1.1色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，粒径5μm） ，或相当者。
7.5.1.2流动相：流动相A+乙腈（65+35，体积比）。
7.5.1.3流速：1 mL/ min。
7.5.1.4紫外检测波长：325 nm。
7.5.1.5柱温：30℃。
7.5.1.6进样量 ：50μL。
7.5.2测定法
取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中青霉素类药物响应值应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液和空白添加试样溶液的高效液相色谱图见附录A。
7.6空白试验
除不加试料外，采用完quan相同的步骤进行平行操作。
8结果计算和表述
试料中青霉素类药物的残留量（μg/kg）按式（1）计算：
式中：
X——供试试料中相应的青霉素类药物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
A——试样溶液中相应的青霉素类药物衍生物峰面积；
cs——标准工作液中相应的青霉素类药物浓度，单位为微克每升（μg/L）；
V——衍生化后所得溶液总体积，单位为毫升（mL）；
As——标准工作液中相应的青霉素类药物衍生物峰面积；
m——供试试料质量，单位为克（g）。
注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
9检验方法灵敏度、准确度和精密度
9.1 灵敏度
本方法青霉素G的检测限为3μg/kg，定量限为10μg/kg，苯唑西林、双氯青霉索、乙氧萘青霉素的检测限为10μg/kg，定量限为50μg /kg。
9.2 准确度
本方法在10μg /kg~600μg/kg添加浓度水平上的回收率为70% ~110%。
9.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
