GB 31656.7-2021 食品安全国家标准
水产品中氯硝柳胺残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件系首ci发布。
1范围
本文件规定了水产品中氯硝柳胺残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于鱼、虾、鳖等水产品可食组织中氯硝柳胺残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性观而构成本不少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件还是日期的引用文件，共最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 30891-2014水产品抽样规范代
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试料中残留的氯硝柳胺，用氨化乙腈提取，C18吸附剂净化、液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。
5试剂和材料
除另有规定外，所有试湖因为分析纯永为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙腈（C2H3N）：色谱纯。
5. 1.2 氨水（NH3·H2O）。
5.1.3无水硫酸镁（Mg2SO4）。
5.2溶液配制
5.2.1氨水使用液：取氨水5 mL，加水5 mL，混匀。
5.2.2氨化乙腈溶液：取氨水使用液100μL：加乙腈至100 mL，混匀。
5. 2.3 70%乙腈水溶液：取乙腈70 mL，加水30 mL，混匀。
5.3 标准品
氯硝柳胺（Niclosamide，C13H8CI2N2O4，CAS号：50-65-7），含量≥96.0%。
5.4标准溶液制备
5. 4.1 标准储备液（0.1 mg/mL）：取氯硝柳胺标准品10 mg，精密称定，加乙腈10 mL，超声使溶解，用乙腈稀释定容至100 mL棕色容量瓶，摇匀，即得。-18℃以下保存，有效期2个月。
5.4.2标准工作液（1μg/mL）：准确量取标准储备液1 mL，于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。-18℃以下保存，有效期1个月。
5.5 材料
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
6.2分析天平：感量 0.01 g和感量0. 00001 g。
6.3 离心机：8 000 r/min或以上。
6.4涡旋混合器。
6.5超声波清洗仪。
6.6 氮吹仪。
6.7具塞聚丙烯离心管：50 mL。
6.8具塞离心管：10 mL、25 mL。
7试料的制备与保存
7.1试料的制备
按GB/T 30891-2014 中附录B的要求制样。
a） 取均质的供试样品，作为供试试料；
b） 取均质的空白样品，作为空白试料；
c） 取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
7.2试料的保存
- 18℃以下保存。
8测定步骤
8.1 提取
取试料5 g（准确至±0.02 g），于50 mL具塞离心管中，加氨化乙腈溶液10 mL，涡旋混合1 min，超声10min，加无水硫酸镁3g，涡旋混合1min，5000r/min离心5min，取上清液移至25mL容量瓶中，残渣用氨化乙腈10mL重复提取一次，合并上清液，用乙腈稀释定容至刻度，混匀，备用。
8.2净化
准确量取上述备用液5 mL于10 mL离心管中，45℃下氮气吹干，用70%乙腈水溶液1.0 mL溶解残渣，再加入C18吸附剂50mg涡旋振荡30s，8000r/min离心6min，取上清液过0.22μm有机系滤膜，供LC-MS/MS测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
取空白样品6份，按照7.1步骤提取，准确量取氯硝柳胺标准工作液5μL、10μL、25μL、50μL、100μL、200μL分别加入到6份空白样品提取液中，按照8.2步骤净化，取上清液，配制成氯硝柳胺浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列基质匹配标准溶液，过滤，供LCMS/MS测定。以测得的氯硝柳胺定量离子峰面积为纵坐标、对应的浓度为横坐标，绘制基质标准曲线。求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1液相色谱参考条件
a） 色谱柱：C18（150 mm×2. 1mm，5μm），或相当者；
b） 柱温：35℃；
c） 流速：0.2 mL/min；
d） 进样量：10uL；
e） 流动相： A为乙腈，B为水，梯度洗脱程序见表1。
8.4.2质谱参考条件
a） 离子化模式：电喷雾离子源（ESI），负离子模式；
b） 喷雾电压：2500 V；
c） 鞘气压力：40 L/min；
d） 辅助气压力：5 L/min；
e） 离子传输管温度：330℃；
f） 扫描模式：选择反应监测（SRM），选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2；
g） 碰撞气：氩气。
8.4.3 测定法
取试料溶液和基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量，外标法计算。试料溶液和基质匹配标准溶液中氯硝柳胺的特征离子质量色谱峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。试料液中氯硝柳胺的保留时间与基质匹配标准工作液中氯硝柳胺的保留时间之比，偏差在±2.5%以内。试料溶液中的相对离子丰度与基质匹配标准溶液中的相对离子丰度相比，符合表3的要求。标准溶液特征离子质量色谱图见附录A。
8.4.4空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试料中氯硝柳胺的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试料中氯硝柳胺残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
Cs——试样溶液中氯硝柳胺浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
A——试样溶液色谱图中氯硝柳胺峰峰面积；
As——标准溶液色谱图中氯硝柳胺峰峰面积；
V1——试料提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；
V2——准确移取的备用液体积的数值，单位为毫升（mL）；
V3——最终溶解残渣液体积的数值，单位为毫升（mL） ；
m——供试试料质量的数值，单位为克（g）。
10 检测方法灵敏度、准确度、精密度
10.1灵敏度
本方法的检测限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg。
10.2准确度
本方法在0. 5μg/kg~20μg/kg添加浓度水平上的回收路为70%~110%。
10.3 精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。
