GB 31656.12-2021 食品安全国家标准
水产品中青霉素类药物多残留的测定
液相色谱-串联质谱法
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替GB/T 22952-2008《河豚鱼和鳗鱼中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、双氯西林残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，与GB/T22952-2008相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下：
a） 更改了标准的适用范围（见1，2008年版的1）；
b） 增加了阿洛西林和甲氧西林的测定（见表2、附录A表A.1）；
c） 更改了定量方法（见8.5.2，2008年版的7.4.2）；
d） 更改了部分测定步骤（见8，2008年版的7）；
e） 增加了固相萃取和超滤管离心的净化步骤（见8.2）；
I） 更改了方法的检出限和定量限（见10. 1，2008年版的1）。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：
——2008年首CI发布为GB/T 22952-2008；
——本次为第一次修订。
1范围
本文件规定了水产品中青霉素类药物残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于鱼、虾、鳖和海参等水产品可食组织中阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、哌拉西林、阿洛西林和甲氧西林单个或多个药物残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不KE少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 30891-2014 水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试料中残留的青霉素类药物，用乙腈水溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。
5.1 试剂
5.1. 1乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5. 1.2 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
5.2溶液配制
5.2.1 30%乙腈水溶液：取乙腈30 mL、水70 mL，混合。
5.2.2 80%乙腈水溶液：取乙腈400 mL、水100 mL，混合。
5.2.3 0.05%甲酸水溶液：取甲酸250μL，加水稀释至500mL。
5.2.4 0.05%甲酸乙腈溶液：取甲酸250μL，加乙腈稀释至500mL。
5.3标准品
5.3. 1青霉素类药物： 阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、哌拉西林、阿洛西林和甲氧西林，含量均≥95%，具体内容见附录A。
5.3.2 内标：阿莫西林-d4，氨苄西林-d5、青霉素G-d7、萘夫西林-d6，含量均≥95%，具体内容见附录A。
5.4 标准溶液制备
5.4.1 青霉素标准储备液（0.10 mg/mL）：取青霉素类药物标准品约10 mg，精密称定，用30%乙腈水溶液溶解并稀释定容至100 mL，配制成浓度均为0.10 mg/mL的标准储备液。-18℃避光保存，有效期5 d。
5.4.2内标储备液（0.10mg/mL）：取内标标准品约10mg，精密称定，用30%乙腈水溶液溶解并稀释定容至100 mL，配制成浓度均为0.10 mg/mL的内标储备液。-18℃避光保存，有效期5 d。
5.4.3混合标准中间液（1.0μg/mL）：分别精密量取青霉素标准储备液适量，用水稀释制成阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、哌拉西林、阿洛西林和甲氧西林浓度均为1.0μg/mL的混合标准溶液。-4℃避光保存，有效期5 d。
5.4.4 内标工作液（1.0μg/mL）：分别精密量取内标储备液适量，用水稀释制成阿莫西林-d4、氨苄西林-d5、青霉素G-d7、萘夫西林-d6浓度均为1.0μg/mL的内标工作液。-4℃避光保存，有效期5 d。
5.5 材料
5.5.1通过式反相混合型亲水亲脂固相萃取柱：200mg/6mL，或相当者。
5.5.2超滤管：10 kD，0.5 mL。
6仪器与设备
6.1液相色谱-串联四极杆质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2 分析天平：感量0.01 g和0.0001 g。
6.3 高速冷冻离心机。
6.4固相萃取装置。
6.5超声波清洗仪。
6.6 组织匀浆机。
6.7涡旋混合 器。
6.8氮吹仪。
7试料的制备与保存
7.1试料的制备
按GB/T 30891-2014 附录B的要求制样。
a） 取均质的供试样品，作为供试试料；
b） 取均质的空白样品，作为空白试料；
c） 取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
7.2试料的保存
-18℃以下保存，3个月内进行分析检测。
8测定步骤
8.1 提取
取试料2.5 g（准确至±0.02 g），加内标工作液100μL，静置10 min，加80%乙腈水溶液5 mL，涡旋混合1 min，超声10 min，4℃ 10000 r/min离心5 min，取.上清液，残渣加80%乙腈水溶液4 mL重复提取一次，合并上清液，用80%乙腈水溶液稀释至10.0 mL，备用。
8.2 净化
取80%乙腈水溶液约1 mL润洗固相萃取柱，弃去流出液，取备用液2.0 mL过柱，保持流速为1滴/s，收集流出液，35℃氮气吹至少于0.5 mL，加水定容至0.5 mL，用超滤管以12000 r/min离心10 min，取滤液，供液相色谱串联质谱测定。
8.3 标准曲线的制备
精密量取混合标准中间液、内标工作液适量，用水配制成青霉素类药物浓度为2μg/L、5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、150μg/L和300μg/L 的混合标准工作液，其中青霉素内标溶液浓度均为40μg/L。以测得特征离子质量色谱峰外标和内标峰面积比值为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4. 1液相色谱参考条件
a） 色谱柱：C18色谱柱（2.1mm×100mm，2.6μm），或性能相当者；
b） 柱温：35℃；
c） 流速：0.4 mL/min；
d） 进样量：10μL；
e） 流动相：A为0. 05%的甲酸水溶液，B为0. 05%的甲酸乙腈溶液。梯度洗脱条件见表1。
8.4.2 质谱参考条件
a） 离子化模式：电喷雾离子源（ESI），多反应监测（MRM），正离子模式；
b） 喷雾电压：5.5 kV；
c） 气帘气压力：0.24 MPa；
d） 碰撞气压力：0.02 MPa；
e） 离子源温度：500℃；
f） 碰撞室入口电压：10 V；
g） 碰撞室出口电压：12 V；
h） 驻留时间：50 ms；
i） 离子源Gasl：0.34 MPa；
j） 离子源Gas2：0. 34 MPa；
k） 多反应监测母离子、子离子、解簇电压和碰撞能量见表2。
8.5 测定法
8.5. 1定性测定
在同样测试条件下，试料溶液中青霉素类药物的保留时间与标准工作液中青霉素类药物的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应与浓度相当的标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3的要求。
8.5.2 定量测定
取试料溶液和混合标准工作溶液等体积进样测定，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量，按内标法计算，其中阿莫西林以阿莫西林-d4为内标，氨苄西林以氨苄西林-d5为内标，青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林和双氯西林以青霉素G-d7为内标、萘夫西林、哌拉西林、阿洛西林和甲氧西林以萘夫西林-d6为内标。标准溶液及试料溶液中青霉素类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述液相色谱-质谱条件下，标准溶液中特征离子质量色谱图见附录B。
8.6 空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试料中青霉素类药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试料中被测物质残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
CS——标准工作溶液中被测物质浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
CiS——试料溶液中内标浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
C'is——标准工作溶液中内标浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
A——试料溶液中被测物质的峰面积；
A'is——标准工作溶液中内标的峰面积；
As——试料溶液中内标的峰面积；
As——标准工作溶液中被测物质的峰面积；
V——试料溶液浓缩后定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
V1——试料提取液体积的数值.单位为毫升（mL）；
V2——试料提取液过柱体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试料质量的数值，单位为克（g）。
10检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10.1 灵敏度
本方法的检出限：氨苄西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、哌拉西林、阿洛西林、甲氧西林均为2μg/kg，阿莫西林为10μg/kg。
本方法的定量限： 氨苄西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、哌拉西林、阿洛西林、甲氧西林均为5μg/kg，阿莫西林为25μg/kg。
10.2 准确度
本方法中氨苄西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、哌拉西林、阿洛西林、甲氧西林添加浓度为5μg/kg~300μg/kg，阿莫西林添加浓度为25μg/kg~300μg/kg的回收率均为70% ~ 120%。
10.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤15% ，批间相对标准偏差≤15%。
