中华人民共和国国家标准
GB 31656.11-2021
代替GB/T 22961-2008
食品安全国家标准
水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定
National food safety standard-
Determination of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline
and doxycycline residues in aquatic products
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替GB/T 22961-2008， 并增加液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件方法一对GB/T 22961-2008《河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法》进行修订。本文件与GB/T 22961-2008 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下：
——更改了标准的适用范围（见1、2008年版的1）；
——更改了方法的检测器，由紫外检测器改为荧光检测器（见6.1、2008年版的5.1）；
——更改了方法的部分测定步骤和检出限（见8、2008年版的7）。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：
——GB/T 22961-2008；
——本次为第一次修订。
1范围
本文件规定了水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量测定的高效液相色谱法。
本文件适用于鱼、虾、蟹、鳖及海参等水产品可食组织中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可（ke）少的条款。其中注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 30891-2014 水产品抽样规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中土霉素，四环素、金霉素和多西环素经柠檬酸缓冲液提取后，固相萃取柱净化，液相色谱荧光检测器检测，外标法定量。
5试剂与材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5.1.2乙酸镁（C4H6O4Mg·4H20）。
5.1.3 咪唑（C3H4N2）。
5.1.4 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
5.1.5柠檬酸（C9H8O7•H2O）：优级纯。
5.1.6 磷酸氢二钠（Na2HPO4）：优级纯。
5.1.7 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA•2H2O）：优级纯。
5.1.8 冰乙酸（CH3COOH）。
5.2溶液配制
5.2.1磷酸二氢钾溶液：取磷酸二氢钾13.6g，加水适量使溶解并稀释至1000mL。
5.2.2甲醇溶液：取甲醇5 mL、水95 mL，混匀。
5.2.3柠檬酸缓冲液：取柠檬酸6.30g、磷酸氢二钠13.8g、乙二胺四乙酸二钠1.86g，加水400mL使溶解，用冰乙酸调pH至4.0，再用水稀释至500 mL。
5.2.4咪唑缓冲溶液：取咪唑68.0g、乙二胺四乙酸二钠0.40g、乙酸镁10.0g，加水800mL使溶解，用冰乙酸调pH至7.2，再用水稀释至1 000 mL，经0. 45μm水相微孔滤膜过滤后备用。
5.2.5甲醇咪唑缓冲溶液：取甲醇20 mL、咪唑缓冲溶液80 mL，混匀。
5.3 标准品
盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸多西环素，含量均≥95%，具体见附录A。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液（100μg/mL）：分别准确称取适量标准品，用甲醇溶解稀释定容配制成土霉素、四环素、金霉素和多西环素浓度均为100μg/mL 的标准储备液。-18℃以下避光储存，有效期1个月。
5.4.2混合标准中间液：分别准确移取土霉素、四环素、金霉素和多西环素标准储备液1.0 mL、1.0 mL、2.0mL和2.0mL于100mL容量瓶，用甲醇稀释并定容，配制成土霉素、四环素、金霉素和多西环素浓度分别为1.0μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL和2.0μg/mL的混合标准中间液。-18℃以下避光储存，有效期为7 d。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：500 mg/6 mL，Oasis HLB或性能相当者。
5.5.2水相微孔滤膜：0. 22μm。
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。
6.2分析天平：感量0.01 g。
6.3分析天平：感量 0.00001 g。
6.4涡旋振荡器。
6.5离心机：转速 6 000 r/min或以上。
6.6固相萃取装置（带负压抽滤器）。
6.7氮吹仪。
6.8组织匀浆机。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
按GB/T 30891-2014附录B的要求制样。
a） 取均质后的供试样品，作为供试试样；
b） 取均质后的空白样品，作为空白试样；
c） 取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1 提取
取试样5g（准确至±0.05g），加柠檬酸缓冲液20mL，涡旋震荡2min，超声提取10min，以6000r/min离心10 min，取上清液于另一50 mL离心管中。向残渣加柠檬酸缓冲液10 mL，重复提取2次，合并3次上清液，待净化。
8.2净化
将Oasis HLB固相萃取柱依次用甲醇10 mL、水10 mL、柠檬酸缓冲液5 mL活化，移入待净化液，用甲醇溶液10mL，水10mL淋洗，抽干，加甲醇10mL洗脱，收集洗脱液，40C氮气吹干，加磷酸二氢钾溶液1.0 mL溶解残渣，超声1min，过0.22μm水相微孔滤膜后，供高效液相色谱测定。
8.3标准曲线的制备
准确移取土霉素、四环素、金霉素和多西环素混合标准中间溶液适量，用甲醇咪唑缓冲溶液稀释成土霉素和四环素浓度分别为50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL，金霉素和多西环素浓度分别为100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL的混合标准系列工作溶液供高效液相色谱测定。以待测物峰面积为纵坐标、相应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。计算回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
a）色谱柱：C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），或相当者；
b）柱温：40℃；
c） 进样量：30μL；
d）流速：0.8 mL/min；
e）激发波长：380 nm；
f）发射波长：520 nm；
g）流动相：甲醇-咪唑缓冲溶液。
8.4.2 测定法
取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量，外标法计算。标准工作液及试样溶液中土霉素、四环素、金霉素和多西环素响应值应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液的高效液相色谱图见附录B中的图B. 1。
8.5空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测物残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素含量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
A——试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的峰面积；
As——标准溶液中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的峰面积；
Cs——标准溶液中土霉素、四环素、金霉素和多西环素浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——最终试样定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——供试试样质量的数值，单位为克（g）。
10 检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10. 1灵敏度
本方法在水产品可食组织中土霉素和四环素的检测限均为10.0μg/kg，多西环素和金霉素的检测限均为20.0μg/kg；土霉素和四环素的定量限均为20.0μg/kg，多西环素和金霉素定量限均为40.0μg/kg。
10.2 准确度
土霉素和四环素在20.0μg/kg~200μg/kg添加浓度的回收率为60%~110%；多西环素和金霉素在40.0μg/kg~ 400μg/kg添加浓度的回收率为60%~110%。
10.3 精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
