GB 5009.22-2016 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定

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GB 5009.22-2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定.jpg

中华人民共和国国家标准

GB 5009.22-2016

食品安全国家标准

食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定

 

前言

  本标准代替GB/T 5009.22- 2003(食品中黄曲霉毒素B1的测定》、GB/T 5009.23-2006《食品中黄曲霉毒素B1B2G1G2的测定》、GB 5009.24-2010《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1B1的测定》.GB/T 23212-20086 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1B2G1G2M1M2的测定液相色谱-荧光检测法》、GB/T 18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》、SN 0339-1995《出口茶叶中黄曲霉毒素B1检验方法》、SN/T 1664-2005《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1B1B2G1G2含量的测定》、SN/T 1101-2002《进出口油籽及粮谷中黄曲霉毒素的检验方法》、SN 0637-1997《出口油籽、坚果及坚果制品中黄曲霉毒素的检验方法 液相色谱法》、SN/T 1736-2006进出口蜂蜜中黄曲霉毒素的检验方法 高效液相色谱法》、NY/T 1286-2007《花生黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法》。

  本标准与GB/T 5009.22-2003相比,主要变化如下:

  ——标准名称修改为“食品安全国家标准食品中 黄曲霉毒素B族和G族的测定";

  ——根据GB 2761-2011的要求,增加了方法的适用范围;

  ——增加了同位素稀释液相色谱串联质谱法为第一法;

  ——增加了高效液相色谱柱前衍生法为第二法:

  ——增加了高效液相色谱柱后衍生法为第三法:

  ——修改了酶联免疫法,并将方法名称更改为酶联免疫吸附筛查法:

  ——增加了免疫亲和柱以及酶联免疫试剂盒质量判定要求与方法;

  ——修改了测定组分为黄曲霉毒素B族和G族化合物。

 

1范围

  本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2(以下简称AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2)的测定方法。

  本标准第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的测定。

  本标准第二法为高效液相色谱-柱前衍生法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的测定。

  本标准第三法为高效液相色谱-柱后衍生法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的测定。

  本标准第四法为酶联免疫吸附筛查法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFT B1的测定。

  本标准第五法为薄层色谱法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、味品中AFT B1的测定。

 

第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法

 

2原理

  试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取,提取液用含1%Triton X-100(或吐温-20)的磷酸盐缓冲溶液稀释后(必要时经黄曲霉毒素固相净化柱初步净化),通过免疫亲和柱净化和富集,净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离,串联质谱检测,同位素内标法定量。

 

3试剂和材料

  除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1试剂

3.1.1乙腈(CH3CN :色谱纯。

3.1.2甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.3乙酸铵(CH3 COONH4):色谱纯。

3.1.4氯化钠(NaCl)。

3.1.5 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。

3.1.6磷酸二氢钾(KH2PO4)。

3.1.7氯化(hua)钾(KCl)。

3.1.8 盐酸(HCl)。

3.1.9 Triton X-100[C14H22OC2H4On](或吐温-20C58H114O26)。

3.2试剂配制

3.2.1乙酸铵溶液(5 mmol/L):称取0.39 g乙酸铵,用水溶解后稀释至1 000 mL,混匀。

3.2.2乙腈-水溶液(84+16):取840 mL乙腈加入160 mL水,混匀。

3.2.3甲醇-水溶液(70+30):取700 mL甲醇加入300 mL水,混匀。

3.2.4乙腈-水溶液(50+50):取50 mL乙腈加入50 mL水,混匀。

3.2.5乙腈-甲醇溶液(50+50):取50 ml乙腈加入50 mL甲醇,混匀。

3.2.6 10%盐酸溶液:取1 mL盐酸,用纯水稀释至10 mL,混匀。

3.2.7磷酸盐缓冲溶液(以下简称PBS):称取8.00 g氯化钠、1.20 g磷酸氢二钠(或2.92 g十二水磷酸氢二钠)、0.20 g磷酸二氢钾、0.20 g氯化(hua)钾,用900 mL水溶解,用盐酸调节pH7.4±0.1,加水稀释至1000mL

3.2.8 1% Triton X-100(或吐温-20)的PBS:取10 mL Triton X-100(或吐温-20),用PBS稀释至1 000 mL

3.3 标准品

3.3.1 AFT B1标准品(C17H12O6CAS1162-65-8 :纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

3.3.2 AFT B2标准品(C17H14O6CAS7220-81-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

3.3.3 AFT G1标准品(C17H12O7CAS1165-39-5):纯度≥98% ,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

3.3.4 AFT G2标准品(C17H14O7CAS7241-98-7):纯度≥98% ,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

3.3.5同位素内标13C17-AFT B1C17H12O6CAS1217449-45-0 :纯度≥98%,浓度为0.5μg/ ml

3.3.6同位素内标13C17-AFT B2C17H14O6CAS1217470-98-8 :纯度≥98%,浓度为0.5μg/ ml

3.3.7同位素内标13C17-AFT G1C17H12O7CAS1217444-07-9 :纯度≥98% ,浓度为0.5μg/ml

3.3.8同位素内标13C17-AFT G2C17H14O7CAS1217462-49-1 :纯度≥98% ,浓度为0.5μg/mL

  注:标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液。

3.4标准溶液配制

3.4.1标准储备溶液(10μg/mL):分别称取AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2 1 mg(精确至0.01 mg),用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液浓度约为10μg/mL。溶液转移至试剂瓶中后,在-20℃下避光保存,备用。临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)。

3.4.2混合标准工作液(100 ng/mL):准确移取混合标准储备溶液(1.0μg/mL1.00 mL 100 mL容量瓶中,乙腈定容。此溶液密封后避光-20℃下保存,三个月有效。

3.4.3混合同位素内标工作液(100 ng/mL):准确移取0.5μg/mL 13C17-AFT B113C17-AFT B213C17-AFT G113C17-AFT G22.00 mL,用乙腈定容至10 mL。在-20℃下避光保存,备用。

3.4.4标准系列工作溶液:准确移取混合标准工作液( 100 ng/mL10μL50μL100μL200μL500μL800μL1000μL10mL容量瓶中,加入200μL 100ng/mL的同位素内标工作液,用初始流动相定容至刻度,配制浓度点为0.1 ng/ML0.5 ng/mL1.0 ng/mL2.0 ng/mL5.0 ng/mL8.0 ng/mL10.0 ng/mL的系列标准溶液。

 

4仪器和设备

4.1 匀浆机。

4.2高速粉碎机。

4.3组织捣碎机。

4.4超声波/涡旋振荡器或摇床。

4.5 天平:感量0.01 g0.00001 g

4.6涡旋混合器。

4.7 高速均质器:转速6 500 r/ min~24 000 r/min

4.8 离心机:转速≥6 000 r/ min

4.9 玻璃纤维滤纸:快速、高载量、液体中颗粒保留1.6 μm

4.10固相萃取装置(带真空泵)。

4.11 氮吹仪。

4.12 液相色谱-串联质谱仪:带电喷雾离子源。

4.13 液相色谱柱。

4.14 免疫亲和柱:AFT B1柱容量≥200ngAFT B1柱回收率≥80%AFT G2的交叉反应率≥80%(验证方法参见附录B)。

  注:对于不同批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。

4.15黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱或功能相当的固相萃取柱(以下简称净化柱):对复杂基质样品测定时使用。

4.16微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用)。

4.17 筛网:1 mm~2 mm试验筛孔径。

4.18 pH计。

 

5分析步骤

  使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能会略有不同,应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。

  警示:整个分析操作过程应在指(zhi)定区域内进行。该区域应避光(直射阳光)、具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。

5.1 样品制备

5.1.1 液体样品(植物油、酱油、醋等)

  采样量需大于1 L,对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后,其中任意的100 gmL)样品进行检测。

5.1.2 固体样品(谷物及其制品、坚果及籽类、婴幼儿谷类辅助食品等)

  采样量需大于1 kg,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径小于2 mm孔径试验筛,混合均匀后缩分至100 g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。

5.1.3半流体(腐乳、豆豉等)

  采样量需大于1 kgL),对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),用组织捣碎机捣碎混匀后,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。

5.2 样品提取

5.2.1液体样品

5.2.1.1植物油脂

  称取5g试样(精确至0.01 g)于50 ml离心管中,加入100μL同位素内标工作液(3.4.3)振荡混合后静置30 min。加入20 mL乙腈-水溶液(84+ 16)或甲醇-水溶液(70+ 30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20 min(或用均质器均质3 min),在6000 r/min下离心10 min,取上清液备用。

5.2.1.2酱油、醋

  称取5g试样(精确至0.01 g)于50 ml.离心管中,加入125 μL同位素内标工作液振荡混合后静置30 min。用乙腈或甲醇定容至25 mL(精确至0.1 mL),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。

5.2.2固体样品

5.2.2.1一般固体样品

  称取5g试样(精确至0.01 g)于50 ml.离心管中,加入100 μL同位素内标工作液振荡混合后静置30 min。加入20.0 mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20 min(或用均质器均质3 min),在 6 000 r/min下离心10 min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。

5.2.2.2婴幼儿配方食 品和婴幼儿辅助食品

  称取5g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入100 μL同位素内标工作液振荡混合后静置30 min。加入20.0 mL乙腈-水溶液(50+ 50)或甲醇-水溶液(70+ 30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20 min(或用均质器均质3 min),在 6 000 r/min下离心10 min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。

5.2.3半流体样

  称取5 g试样(精确至0.01g)于50 ml离心管中,加入100 pμL 同位素内标工作液振荡混合后静置30 min 加入20.0 ml乙腈-水溶液(84+ 16)或甲醇-水溶液(70+30),置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20 min(或用均质器均质3 min),在6 000 r/min下离心10 min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。

5.3样品净化

5.3.1免疫亲和柱净化

5.3.1.1.上样液的准备

  准确移取4 mL上清液,加入46 mL 1% Trition X-100(或吐温-20)的PBS(使用甲醇-水溶液提取时可减半加入),混匀。

5.3.1.2免疫亲和柱的准备

  将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。

5.3.1.3试样的净化

  待免疫亲和柱内原有液体流尽后,将上述样液移至50 mL注射器简中,调节下滴速度,控制样液以1 ml/min~3 mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完后,往注射器筒内加入2×10 ml水,以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统,在亲和柱下部放置10 mL刻度试管,取下50 mL的注射器简,加入2×1 mL甲醇洗脱亲和柱,控制1 mL/min~3 mL/min的速度下滴,再用真空泵抽干亲和柱,收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,加入1.0 mL初始流动相,涡旋30 s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。

5.3.2黄曲霉毒素固相净化柱和免疫亲和柱同时使用(对花椒、胡椒和辣椒等复杂基质)

5.3.2.1净化柱净化

  移取适量上清液,按净化柱操作说明进行净化,收集全部净化液。

5.3.2.2免疫亲和柱净化

  用刻度移液管准确吸取上述净化液4 mL,加入46 ml. 1% Trtion X- 100(或吐温-20)的PBS[使用甲醇-水溶液提取时,加入23mL 1% Trition X-100(或吐温-20)的PBS],混匀。按5.3.1.25.3.1.3处理。

  注:全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。

5.4 液相色谱参考条件

 液相色谱参考条件列出如下:

  a)流动相:A相:5 mmol/L乙酸铵溶液;B相:乙腈-甲醇溶液(50+50);

  b)梯度洗脱:32% B0 min~0.5 min),45% B3 min~4 min),100% B4.2 min~4.8 min),

32% B5.0 min~7.0 min);

  c)色谱柱:C18柱长100 mm柱内径2.1 mm填料粒径1.7 μm,或相当者;

  d)流速:0.3 mL/ min

  e)柱温:40℃;

  f)进样体积:10μL

5.5 质谱参考条件

  质谱参考条件列出如下:

  a)检测方式:多离子反应监测(MRM);

  b)离子源控制条件:参见表1

  c)离子选择参数:参见表2

  d)子离子扫描图:参见图C.1~C.8

  e)液相色谱质 谱图:见图C.9

image.png

image.png

5.6定性测定

  试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化范围应在±2.5%之内。

  每种化合物的质谱定性离子必须出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次,对同一化合物,样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比,其允许偏差不超过表3规定的范围。

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5.7标准曲线的制作

  5.4.5.5的液相色谱串联质谱仪分析条件下,将标准系列溶液由低到高浓度进样检测,以AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2色谱峰与各对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图,得到标准曲线回归方程,其线性相关系数应大于0.99

5.8试样溶液的测定

  5.3处理得到的待测溶液进样,内标法计算待测液中目标物质的质量浓度,按第6章计算样品中待测物的含量。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应适当减少取样量重新测定。

5.9空白试验

    不称取试样,按5.25.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。

 

6分析结果的表述

  试样中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的残留量按式(1)计算:

image.png

  式中:

  X——试样中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的含量,单位为微克每千克(μg/kg);

  ρ——进样溶液中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2按照内标法在标准曲线中对应的浓

        度,单位为纳克每毫升(ng/mL);

  V1——试样提取液体积(植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积;酱油、醋按定容总体积),单位为毫升(mL);

  V3——样品经净化洗脱后的最终定容体积,单位为毫升(mL);

  1000——换算系数;

  V2——用于净化分取的样品体积,单位为毫升(ml);

  m——试样的称样量,单位为克(g)。

  计算结果保留三位有效数字。

 

7精密度

  在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%

 

8其他

  当称取样品5 g时,AFT B1的检出限为:0.03μg/kgAFT B2的检出限为0.03μg/kgAFT G1的检出限为0.03μg/kgAFT G2的检出限为0.03μg/kgAFT B1的定量限为0.1μg/kgAFT B2的定量限为0.1μg/kgAFT G1的定量限为0.1μg/kgAFT G2的定量限为0.1μg/kg

 

第二法 高效液相色谱-柱前衍生法

 

9原理

  试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2 ,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液经黄曲霉毒素固相净化柱净化去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质,净化液用三氟乙(yi)酸柱前衍生,液相色谱分离,荧光检测器检测外标法定量。

 

10试剂和材料

  除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

10.1 试剂

10.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。

10.1.2乙睛(CH3CN):色谱纯。

10.1.3正己烷(C6H14):色谱纯。

10.1.4三氟乙(yi)酸(CF3COOH)。

10.2试剂配制

10.2.1 乙腈-水溶液(84+16):取840 mL乙腈加入160 mL水。

10.2.2 甲醇-水溶液(70+30):取700 mL甲醇加入300 mL水。

10.2.3乙腈-水溶液(50+50 :取500 mL乙腈加入500 mL水。

10.2.4乙腈-甲醇溶液(50+50):取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。

10.3标准品

10.3.1 AFT B1标准品(C17H2O6CAS号:1162-65-8):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

10.3.2 AFT B2标准品(C17H14O6CAS号:7220-81-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予予标准物质证书的标准物质。

10.3.3 AFT G1标准品(C17H12O7CAS号:1165-39-5):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

10.3.4 AFT G2标准品(C17H14O7CAS号:7241-98-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

  注:标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液。

10.4标准溶液配制

10.4.1 标准储备溶液(10μg/mL):分别称取AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2 1 mg(精确至0.01 mg),用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液浓度约为10μg/mL。溶液转移至试剂瓶中后,在-20℃下避光保存,备用。临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)。

10.4.2 混合标准工作液(AFT B1AFT G1100 ng/mLAFT B2AFT G230 ng/mL):准确移取AFT B1AFT G1标准储备溶液各1 mLAFT B2AFT G2标准储备溶液各300μL100 mL容量瓶中,乙腈定容。密封后避光-20℃下保存,三个月内有效。

10.4.3标准系列工作溶液:分别准确移取混合标准工作液10μL50 μL200μL500μ、1000μL2000μL4000μL10mL容量瓶中,用初始流动相定容至刻度(含AFT B1AFT G1浓度为0.1 ng/mL0.5 ng/mL2.0 ng/mL5.0 ng/mL10.0 ng/mL20.0 ng/mL40.0 ng/ml AFT B2AFT G2浓度为0.03 ng/mL0.15 ng/mL0.6 ng/mL1.5 ng/mL3.0 ng/mL6.0 ng/mL12 ng/mL的系列标准溶液)。

 

11仪器和设备

11.1 匀浆机。

11.2 高速粉碎机。

11.3组织捣碎机。

11.4超声波/涡旋振荡器或摇床。

11.5 天平:感量0.01 g0.00001 g

11.6涡旋混合器。

11.7 高速均质器:转速6 500 r/ min~24 000 r/min

11.8 离心机:转速≥6 000 r/ min

11.9 玻璃纤维滤纸:快速、高载量、液体中颗粒保留1.6 μm

11.10 氮吹仪。

11.11液相色谱仪:配荧光检测器。

11.12 色谱分离柱。

11.13 黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱(以下简称净化柱),或相当者。

11.14一次性微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用)。

11.15筛网:1 mm~2 mm试验筛孔径。

11.16 恒温箱。

11.17 pH计。

 

12分析步骤

12.1 样品制备

12.1.1 液体样品(植物油、酱油、醋等)

  采样量需大于1 L,对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后,其中任意的100 gmL)样品进行检测。

12.1.2 固体样品(谷物及其制品、坚果及籽类、婴幼儿谷类辅助食品等)

  采样量需大于1 kg,用高速粉碎机将其粉碎,过筛.使其粒径小于2 mm孔径试验筛,混合均匀后缩分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。

12.1.3 半流体(腐乳、豆豉等)

  采样量需大于1 kgL),对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),用组织捣碎机捣碎混匀后,储存于样品瓶中密封保存,供检测用。

12.2 样品提取

12.2.1 液体样品

12.2.1.1植物油脂

  称取5 g试样(精确至0.01 g)于50 ml.离心管中,加入20 mL乙腈-水溶液(84+ 16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20 min(或用均质器均质3 min),在6 000 r/min下离心10 min,取上清液备用。

12.2.1.2 酱油、醋

  称取5 g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,用乙腈或甲醇定容至25 mL(精确至0.1 mL),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10 min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。

12.2.2固体样

12.2.2.1 一般固体样品

  称取5g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入20.0 mL乙腈水溶液(84+16)或甲醇水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20 min(或用均质器均质3 min),在6 000 r/min下离心10 min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。

12.2.2.2 婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品

  称取5g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入20.0 mL乙腈水溶液(50+50)或甲醇水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20 min(或用均质器均质3 min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。

12.2.3半流体样品

  称取5g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入20.0 mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20 min(或用均质器均质3 min),在6 000 r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。

12.3 样品黄曲霉毒素固相净化柱净化

  移取适量上清液,按净化柱操作说明进行净化,收集全部净化液。

12.4 衍生

  用移液管准确吸取4.0 mL净化液于10 mL离心管后在50℃下用氮气缓缓地吹至近干,分别加入200μL正己烷和100μL三氟乙(yi)酸,涡旋30 s,在40℃±1℃的恒温箱中衍生15 min,衍生结束后,在50℃下用氮气缓缓地将衍生液吹至近干,用初始流动相定容至1.0 mL,涡旋30 s溶解残留物,过0.22μm滤膜,收集滤液于进样瓶中以备进样。

12.5 色谱参考条件

  色谱参考条件列出如下:

  a)流动相:A相:水.B相:乙腈-甲醇溶液(50+ 50);

  b)梯度洗脱:24% B0 min~6 min),35% B8.0 min~ 10.0 min),100% B10.2 min~11.2 min),24%B11.5 min~13.0 min);

  c)色谱柱:C18柱长150 mm250 mm柱内径4.6 mm填料粒径5.0 μm,或相当者;

  d)流速:1.0 mL/min

  e)柱温:40℃;

  f)进样体积:50μL

  g)检测波长:激发波长360 nm;发射波长440 nm

  h)液相色谱图:参见图D.1

12.6样品测定

12.6.1标准曲线的制作

  系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测,以峰面积为纵坐标浓度为横坐标作图,得到标准曲线回归方程。

12.6.2试样溶液的测定

  待测样液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内,浓度超过线性范围的样品则应稀释后重新进样分析。

12.6.3空白试验

  不称取试样,按12.2.12.312.4的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。

 

13 分析结果的表述

  试样中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的残留量按式(2)计算:

image.png

  式中:

  X——试样中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的含量,单位为微克每千克(μg/kg);

  ρ——进样溶液中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2按照外标法在标准曲线中对应的浓

度,单位为纳克每毫升(ng/mL);

  V1——试样提取液体积(植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积;酱油、醋按定容总体积),单位为毫升(mL);

  V3——净化液的最终定容体积,单位为毫升(mL);

  1 000——换算系数;

  V2——净化柱净化后的取样液体积,单位为毫升(mL);

  m——试样的称样量,单位为克(g)。

  计算结果保留三位有效数字。

 

14精密度

  在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%

 

15其他

  当称取样品5 g时,柱前衍生法的AFT B1的检出限为0.03μg/kgAFT B2的检出限为0.03μg/kgAFT G1的检出限为0.03μg/kgAFT G2的检出限为0.03μg/ kg;柱前衍生法的AFT B1的定量限为0.1μg/kgAFT B2的定量限为0.1μg/kgAFT G1的定量限为0.1μg/kgAFT G2的定量限为0.1μg/kg

 

第三法高效液相色谱 -柱后衍生法

 

  导语:下述方法的仪器检测部分,包括碘或溴试剂衍生、光化学衍生、电化学衍生等柱后衍生方法,可根据实际情况,选择其中一种方法即可。

 

16 原理

  试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2,用乙腈水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液经免疫亲和柱净化和富集,净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离,柱后衍生(碘或溴试剂衍生、光化学衍生、电化学衍生等),经荧光检测器检测,外标法定量。

 

17试剂和材料

  除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

17.1 试剂

17.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。

17.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。

17.1.3氯化钠(NaCl)。

17.1.4磷酸氢二钠(Na2HPO4)。

17.1.5磷酸二氢钾(KH2PO4)。

17.1.6氯化(hua)钾(KCl)。

17.1.7盐酸(HCl)。

17.1.8 Triton X- 100[C14H22OC2H4On](或吐温-20C58H114O26)。

17.1.9 碘衍生使用试剂:碘(I2)。

17.1.10 溴衍生使用试剂:三溴化吡啶(C5H6Br3N2)。

17.1.11电化学衍生使用试剂:溴化钾(KBr)、浓硝酸(HNO3)。

17.2试剂配制

17.2.1乙腈-水溶液(84+16):取840 mL乙腈加入160 mL水。

17.2.2甲醇水溶液(70+30):取700 mL甲醇加入300 mL水。

17.2.3乙腈-水溶液(50+50):取500 mL乙腈加入500 mL水。

17.2.4乙腈-水溶液(10+90):取100 mL乙腈加入900 mL水。

17.2.5乙腈-甲醇溶液(50+50):取500mL乙腈加入500mL甲醇。

17.2.6磷酸盐缓冲溶液(以下简称PBS):称取8.00 g氯化钠、1.20 g磷酸氢二钠(或2.92 g十二水磷酸氢二钠)、0.20g磷酸二氢钾、0.20 g氯化(hua)钾,用900 mL水溶解,用盐酸调节pH7.4,用水定容至1 000 mL

17.2.7 1%Triton X- 100(或吐温20)的PBS:取10 mL Triton X- 100,用PBS定容至1 000 mL

17.2.8 0.05%碘溶液:称取0.1 g碘,用20 mL甲醇溶解,加水定容至200 mL,用0.45 μm的滤膜过滤,现配现用(仅碘柱后衍生法使用)。

17.2.9 5 mg/L三溴化吡啶水溶液:称取5 mg三溴化吡啶溶于1 L水中,用0.45 μm的滤膜过滤,现配现用(仅溴柱后衍生法使用)。

17.3 标准品

17.3.1 AFT B1标准品(C17H12O6CAS号:1162-65-8):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

17.3.2 AFT B2标准品(C17H14O6CAS号:7220-81-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

17.3.3 AFT G1标准品(C17H12O7CAS号:1165-39-5 :纯度≥98% ,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

17.3.4 AFT G2标准品(C17H14O7CAS号:7241-98-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

  注:标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液。

17.4标准溶液配制

17.4.1 标准储备溶液(10 1g/mL):分别称取AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2 1 mg(精确至0.01 mg),用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液浓度约为10μg/mL。溶液转移至试剂瓶中后,在-20℃下避光保存,备用。临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)。

17.4.2 混合标准工作液(AFT B1AFT G1100 ng/mLAFT B2AFT G230 ng/mL :准确移取AFT B1,和AFT G1标准储备溶液各1 mLAFT B2AFT G2标准储备溶液各300μL100 mL容量瓶中,乙腈定容。密封后避光-20℃下保存,三个月内有效。

17.4.3标准系列工作溶液:分别准确移取混合标准工作液10μL50μL200μL500μL1 000μL2000μL4000μL10mL容量瓶中,用初始流动相定容至刻度(含AFT B1AFT G1浓度为0.1 ng/mL0.5 ng/mL2.0 ng/mL5.0 ng/mL10.0 ng/mL20.0 ng/mL40.0 ng/mL AFT B2AFT G2浓度为0.03 ng/mL0.15 ng/mL0.6 ng/mL1.5 ng/mL3.0 ng/mL6.0 ng/mL12 ng/mL的系列标准溶液)。

 

18仪器和设备

18.1 匀浆机。

18.2高速粉碎机。

18.3组织捣碎机。

18.4超声波/涡旋振荡器或摇床。

18.5 天平:感量0.01 g0.00001 g

18.6 涡旋混合器。

18.7 高速均质器:转速6 500 r/min~24 000 r/ min

18.8 离心机:转速≥6 000 r/ min

18.9 玻璃纤维滤纸:快速、高载量、液体中颗粒保留1.6 pm

18.10 固相萃取装置(带真空泵)。

18.11 氮吹仪。

18.12液相色谱仪:配荧光检测器(带-般体积流动池或者大体积流通池)。

  注:当带大体积流通池时不需要再使用任何型号或任何方式的柱后衍生器。

18.13 液相色谱柱。

18.14 光化学柱后衍生器(适用于光化学柱后衍生法)。

18.15 溶剂柱后衍生装置(适用于碘或溴试剂衍生法)。

18.16 电化学柱后衍生器(适用于电化学柱后衍生法)。

18.17 免疫亲和柱:AFT B1柱容量≥200 ngAFT B1柱回收率≥80%AFT G2的交叉反应率≥80%(验证方法参见附录B)。

  注:对于每个批次的亲和柱使用前需质量验证。

18.18 黄曲霉毒素固相净化柱或功能相当的固相萃取柱(以下简称净化柱):对复杂基质样品测定时使用。

18.19一次性微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用)。

18.20 筛网:1 mm~2 mm试验筛孔径。

 

19分析步骤

  使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品的上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同,应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。

  警示:整个分析操作过程应在指(zhi)定区域内进行。该区域应避光(直射阳光)、具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。

19.1样品制备

  12.1

19.2 样品提取

  12.2

19.3样品净化

19.3.1免疫亲和柱净化

19.3.1.1.上样液的准备

  准确移取4 mL上述上清液,加入46 mL 1% Triton X- 100(或吐温20)的PBS(使用甲醇水溶液提取时可减半加入),混匀。

19.3.1.2免疫亲和柱的准备

  将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。

19.3.1.3试样的净化

  免疫亲和柱内的液体放弃后,将上述样液移至50 mL注射器简中,调节下滴速度,控制样液以1 mL/min~3 mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完后,往注射器筒内加入2×10 ml水,以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统,在亲和柱下部放置10 mL刻度试管,取下50 mL的注射器筒,2×1 mL甲醇洗脱亲和柱.控制1 mL/min~3 mL/min的速度下滴,再用真空泵抽干亲和柱,收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,用初始流动相定容至1.0 mL,涡旋30 s溶解残留物,0.22 μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。

19.3.2黄曲霉毒素固相净化柱和免疫亲和柱同时使用(对花椒、胡椒和辣椒等复杂基质)

19.3.2.1 化柱净化

  移取适量上清液,按净化柱操作说明进行净化,收集全部净化液。

19.3.2.2免疫亲和柱净化

  用刻度移液管准确吸取上部净化液4 mL,加入46 mL 1% Triton X- 100(或吐温-20)的PBS 使用甲醇水溶液提取时可减半加入),混匀。按19.4.1.3 处理。

  注:全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。

19.4 液相色谱参考条件

19.4.1 无衍生器法(大流通池直接检测)

  液相色谱参考条件列出如下:

  a)流动相:A相,水;B相,乙腈甲醇(50+50);

  b)等梯度洗脱条件:A65% B35%

  c)色谱柱:C18柱长100 mm柱内径2.1 mm填料粒径1.7μm,或相当者;

  d)流速:0.3 mL/min

  e)柱温:40℃;

  f)进样量:10μL

  g)激发波长:365 nm;发射波长:436 nmAFT B1AFT B2),463 nmAFT G1AFT G2);

  h)液相色谱图见图D.2

19.4.2 柱后光化学衍生法

  液相色谱参考条件列出如下:

  a)流动相:A相,水;B相,乙腈-甲醇(50+50);

  b)等梯度洗脱条件:A68% B32%

  c)色谱柱:C18柱(柱长150 mm250 mm,柱内径4.6 mm,填料粒径5μm),或相当者;

  d)流速:1.0 mL/ min

  e)柱温:40℃;

  f)进样量:50μL

  g)光化学柱后衍生器;

  h)激发波长:360 nm;发射波长:440 nm

  i)液相色谱图见图 D.3

19.4.3 柱后碘或溴试剂衍生法

19.4.3.1柱后碘衍生法

  液相色谱参考条件列出如下:

  a)流动相:A相,水;B相,乙腈-甲醇(50 +50);

  b)等梯度洗脱条件:A68% B32%

  c)色谱柱:C18柱(柱长150 mm250 mm,柱内径4.6 mm,填料粒径5 μm),或相当者;

  d)流速:1.0 mL/ min

  e)柱温:40℃;

  f)进样量:50μL

  g)柱后衍生化系统;

  h)衍生溶液:0.05%碘溶液;

  i)衍生溶液流速:0.2 mL/min

  j)衍生反应管温度:70℃;

  k)激发波长:360 nm;发射波长:440 nm

  l)液相色谱图见图D.4

19.4.3.2 柱后溴衍生法

  液相色谱参考条件列出如下:

  a)流动相:A 相,水;B相,乙腈-甲醇(50+50);

  b)等梯度洗脱条件:A68% B.32%

  c)色谱柱:C18柱长150 mm250 mm柱内径4.6 mm填料粒径5 μm ,或相当者;

  d)流速:1.0 mL/min

  e)色谱柱柱温:40℃;

  f)进样量:50μL

  g)柱后衍生系统;

  h)衍生溶液:5 mg/L三溴化吡啶水溶液;

  i)衍生溶液流速:0.2 mL/ min

  j)衍生反应管温度:70℃;

  k)激发波长:360 nm;发射波长:440 nm

  l)液相色谱图见图D.5

19.4.4 柱后电化学衍生法

  液相色谱参考条件列出如下:

  a)流动相:A相,水(1 L水中含119 mg溴化钾,350μL 4 mol/L硝酸);B相,甲醇;

  b)等梯度洗脱条件:A60%B40%

  c)色谱柱:C18柱(柱长150 mm250 mm,柱内径4.6 mm,填料粒径5μm),或相当者;

  d)柱温:40℃;

  e)流速:1.0 mL/min

  f)进样量:50μL

  g)电化学柱后衍生器:反应池工作电流100μA1PEEK反应管路(长度50 cm,内径0.5 mm);

  h)激发波长:360 nm;发射波长:440 nm

  i)液相色谱图见图D.6

19.5 样品测定

19.5.1标准曲线的制作

  系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测,以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标作图,得到标准曲线回归方程。

19.5.2 试样溶液的测定

  待测样液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内,浓度超过线性范围的样品则应稀释后重新进样分析。

19.5.3空白试验

  不称取试样,按19.319.4 19.5 的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。

 

20分析结果的表述

试样中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的残留量按式(3)计算:

image.png

  式中:

  X——试样中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2的含量,单位为微克每千克(μg/kg);

  ρ——进样溶液中AFT B1AFT B2AFT G1AFT G2按照外标法在标准曲线中对应的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);

  V1——试样提取液体积(植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积;酱油、醋按定容总体积),单位为毫升(mL);

  V3——样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积,单位为毫升(mL);

  V2——用于免疫亲和柱的分取样品体积,单位为毫升(mL);

  1 000——换算系数;

  m——试样的称样量,单位为克(g)。

  计算结果保留三位有效数字。

 

21 精密度

  在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%

 

22其他

  当称取样品5 g时,柱后光化学衍生法、柱后溴衍生法、柱后碘衍生法、柱后电化学衍生法的AFT B1的检出限为0.03μg/kgAFT B2的检出限为0.01μg/kgAFT G1的检出限为0.03μg/kgAFT G2的检出限为0.01μg/kg;无衍生器法的AFT B1的检出限为0.02μg/kgAFT B2的检出限为0.003μg/kgAFT G1的检出限为0.02μg/kgAFT G2的检出限为0.003μg/kg

  柱后光化学衍生法、柱后溴衍生法、柱后碘衍生法、柱后电化学衍生法:AFT B1的定量限为0.1μg/kgAFT B2的定量限为0.03μg/kgAFT G1的定量限为0.1μg/kgAFT G2的定量限为0.03 μg/kg;无衍生器法:AFT B1的定量限为0.05μg/kgAFT B2的定量限为0.01μg/kgAFT G1的定量限为0.05μg/kgAFT G2的定量限为0.01μg/kg

 

第四法 酶联免疫吸附筛查法

 

23原理

  试样中的黄曲霉毒素B1用甲醇水溶液提取,经均质、涡旋、离心(过滤)等处理获取上清液。被辣根过氧化物酶标记或固定在反应孔中的黄曲霉毒素B1,与试样上清液或标准品中的黄曲霉毒素B1竞争性结合特异性抗体。在洗涤后加入相应显色剂显色,经无机酸终止反应,于450 nm630 nm波长下检测。样品中的黄曲霉毒素B1与吸光度在一定浓度范围内呈反比。

 

24试剂和材料

  配制溶液所需试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定二级水。

  按照试剂:盒说明书所述.配制所需溶液。

  所用商品化的试剂盒需按照E中所述方法验证合格后方可使用。

 

25仪器和设备

25.1微孔板酶标仪:带 450 nm630 nm(可选)滤光片。

25.2研磨机。

25.3振荡器。

25.4电子天平:感量0.01 g

25.5离心机:转速≥6000 r/ min.

25.6快速定量滤纸:孔径 11 μm

25.7筛网:1 mm~2 mm孔径。

25.8试剂盒所要求的仪器。

 

26分析步骤

26.1样品前处理

26.1.1液态样品(油脂和调味品)

  100g待测样品摇匀,称取5.0g样品于50 mL离心管中,加入试剂盒所要求提取液,按照试纸盒说明书所述方法进行检测。

26.1.2固态样品(谷物、坚果和特殊膳食用食品

  称取至少100 g样品,用研磨机进行粉碎,粉碎后的样品过1 mm~2 mm孔径试验筛。取5.0g样品于50mL离心管中,加入试剂盒所要求提取液,按照试纸盒说明书所述方法进行检测。

26.2样品检测

  按照酶联免疫试剂盒所述操作步骤对待测试样(液)进行定量检测。

 

27分析结果的表述

27.1酶联免疫试剂盒定量检测的标准工作曲线绘制

  按照试剂盒说明书提供的计算方法或者计算机软件,根据标准品浓度与吸光度变化关系绘制标准工作曲线。

27.2待测液浓度计算

  按照试剂盒说明书提供的计算方法以及计算机软件,将待测液吸光度代入27.1所获得公式,计算得待测液浓度(ρ)。

27.3结果计算

  食品中黄曲霉毒素B1的含量按式(4)计算:

image.png

  式中:

  X——试样中AFT B1的含量,单位为微克每千克(μg/kg);

  ρ——待测液中黄曲霉毒素B1的浓度,单位为微克每升(μg/L);

  V——提取液体积(固态样品为加入提取液体积,液态样品为样品和提取液总体积),单位为升(L);

  f——在前处理过程中的稀释倍数;

  m——试样的称样量,单位为千克(kg)。

  计算结果保留小数点后两位。

  阳性样品需用第一法、第二法或第三法进一步确认。

 

28精密度

  每个试样称取两份进行平行测定,以其算术平均值为分析结果。

  其分析结果的相对相差应不大于20%

 

29其他

  当称取谷物、坚果、油脂、调味品等样品5 g时,方法检出限为1μg/kg,定量限为3μg/kg

  当称取特殊膳食用食品样品5g时,方法检出限为0.1μg/kg,定量限为0.3μg/kg

 

第五法 薄层色谱法

 

30原理

  样品经提取、浓缩、薄层分离后,黄曲霉毒素B1在紫外光(波长365 nm)下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最(zui)低检出量来测定含量。

 

31试剂和材料

  除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

31.1试剂

31.1.1甲醇(CH3OH)。

31.1.2正己烷(C6H14)。

31.1.3石油醚(沸程30~60℃或60~90℃)。

31.1.4三氯(lv)甲烷(CHCl3)。

31.1.5 苯(C6H6)。

31.1.6乙腈(CH3CN)。

31.1.7无水乙(yi)醚(C2H6O)。

31.1.8 丙酮(C3H6O)。

  注:以上试剂在试验时先进行一次试剂空白试验,如不干扰测定即可使用,否则需逐一进行重蒸。

31.1.9硅胶G:薄层层析用。

31.1.10 三氟乙(yi)酸(CF3COOH)。

31.1.11无水硫酸钠(Na2SO4)。

31.1.12 氯化钠( NaCl)。

31.2试剂配制

31.2.1 -乙腈溶液(98+2):取2 mL乙腈加入98 mL苯中混匀。

31.2.2 甲醇水溶液(55+45):取550 mL甲醇加入450 mL水中混匀。

31.2.3甲醇-三氯(lv)甲烷(4+96):取 4 mL甲醇加入96 mL三氯(lv)甲烷中混匀。

31.2.4丙酮-三氯(lv)甲烷(8+92):取 8 mL丙酮加入92 mL三氯(lv)甲烷中混匀。

31.2.5次氯酸钠溶液(消毒用):取100 g漂白粉,加入500 mL水,搅拌均匀。另将80 g工业用碳酸钠(Na2CO3·10H2O)溶于500 mL温水中,再将两液混合、搅拌,澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。若用漂粉精制备,则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10g/L氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后,即可达到去毒效果。

31.3 标准品

  AFT B1标准品(C17H12O6CAS号:1162-65-8):纯度≥98% ,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

31.4 标准溶液配制

31.4.1 AFT B1标准储备溶液(10 rg/mL):准确称取1 mg~1.2 mg AFT B1标准品,先加入2 ml乙腈溶解后,再用苯稀释至100 mL,避光,置于4℃冰箱保存,此溶液浓度约10μg/mL

  纯度的测定:取5μL 10μg/mL AFT B1标准溶液.滴加于涂层厚度0.25 mm的硅胶G薄层板上,用甲醇-三氯(lv)甲烷与丙酮-三氯(lv)甲烷展开剂展开,在紫外光灯下观察荧光的产生,应符合以下条件:

  a)在展开后,只有单一的荧光点,无其他杂质荧光点;

  b)原点上没有任何残留的荧光物质。

31.4.2 AFT B1标准工作液:准确吸取1 mL标准溶液储备液于10 mL容量瓶中,加苯-乙腈混合液至刻度,混匀。此溶液每毫升相当于1.0μg AFT B1。吸取1.0 mL此稀释液,置于5 mL容量瓶中,加苯-乙腈混合液稀释至刻度.此溶液每毫升相当于0.2μg AFT B1。再吸取AFT B1标准榕液(0.2μg/mL1.0mL置于5 mL容量瓶中,加苯-乙腈混合液稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.04μg AFT B1

 

32仪器和设备

32.1圆孔筛:2.0 mm筛孔孔径。

32.2小型粉碎机。

32.3电动振荡器。

32.4全玻璃浓缩器。

32.5玻璃板:5 cm×20 cm

32.6薄层板涂布器。

  注:可选购适用黄曲霉毒素检测的商品化薄层板。

32.7展开槽:长 25 cm,宽6 cm,高4 cm

32.8紫外光灯:100 W~125 W ,带365 nm滤光片。

32.9微量注射器或血色素吸管。

 

33分析步骤

  警示:整个操作需在暗室条件下进行。

33.1样品提取

33.1.1玉米、大米、小麦、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等

33.1.1.1甲法:称取 20.00 g粉碎过筛试样(面粉、花生酱不需粉碎),置于250 mL具塞锥形瓶中,加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水溶液,在瓶塞上涂上一层水,盖严防漏。振荡30 min,静置片刻,以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中,待下层甲醇水带被分清后,放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00 mL甲醇水溶液(相当于4g试样)置于另一125 mL分液漏斗中,加20 mL三氯(lv)甲烷,振摇2 min,静置分层,如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯(lv)甲烷层,经盛有约10g预先用三氯(lv)甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中,再加5mL三氯(lv)甲烷于分液漏斗中,重复振摇提取,三氯(lv)甲烷层一并滤于蒸发皿中,最后用少量三氯(lv)甲烷洗过滤器,洗液并于蒸发皿中。将蒸发血放在通风柜于65℃水浴上通风挥干,然后放在冰盒上冷却2 min~3 min后,准确加入1 mL-乙腈混合液(或将三氯(lv)甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后,准确加入1 ml-乙腈混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合,若有苯的结晶析出,将蒸发皿从冰盒上取出,继续溶解、混合,晶体即消失,再用此滴管吸取上清液转移于2 mL具塞试管中。

33.1.1.2乙法(限于玉米、大米、小麦及其制品):称取20.00 g粉碎过筛试样于250 mL具塞锥形瓶中,用滴管滴加约6 mL水,使试样湿润,准确加入60 mL三氯(lv)甲烷,振荡30 min,加12 g无水硫酸钠,振摇后,静置30 min,用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于100 mL具塞锥形瓶中。取12 mL滤液(相当4 g试样)于蒸发皿中,在65℃水浴锅上通风挥干,准确加入1 mL-乙腈混合液,以下按33.1.1.1 自“用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混......"起依法操作。

33.1.2花生油、香油 、菜油等

  称取4.00g试样置于小烧杯中,用20 mL正己烷或石油醚将试样移于125 mL分液漏斗中。用20 mL甲醇水溶液分次洗烧杯,洗液一并移入分液漏斗中,振摇 2 min,静置分层后,将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中,再用5 mL甲醇水溶液重复振摇提取一次,提取液一并移入第二个分液漏斗中,在第二个分液漏斗中加入20 ml三氯(lv)甲烷,以下按33.1.1.1 自“振摇2 min,静置分层......"起依法操作。

33.1.3 酱油、醋

  称取10.00g试样于小烧杯中,为防止提取时乳化,加0.4 g氯化钠,移入分液漏斗中,用15 mL三氯(lv)甲烷分次洗涤烧杯,洗液一并移入分液漏斗中。以下按33.1.1.1自“振摇2 min 静置分层......"起依法操作,最后加入2.5 mL-乙腈混合液,此溶液每毫升相当于4 g试样。

  或称取10.00 g试样,置于分液漏斗中,再加12 mL甲醇(以酱油体积代替水,故甲醇与水的体积比仍约为55 45),用20 mL三氯(lv)甲烷提取,以下按33.1.1.1自“振摇2 min,静置分层......"起依法操作。最后加入2.5 mL-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4 g试样。

33.1.4 干酱类(包括豆豉、腐乳制品)

  称取20.00 g研磨均匀的试样,置于250 mL具塞锥形瓶中,加入20 mL正己烷或石油醚与50 mL甲醇水溶液。振荡30 min,静置片刻,以叠成折叠式快速定性滤纸过滤,滤液静置分层后,取24 mL甲醇水层(相当8 g试样,其中包括8 g干酱类本身约含有4 mL水的体积在内)置于分液漏斗中,加入20 mL三氯(lv)甲烷,以下按33.1.1.1自“振摇2 min,静置分层......"起依法操作。最后加入2 mL-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4 g试样。

33.2 测定

33.2.1 向展开法

33.2.1.1薄层板的制备

  称取约3 g硅胶G,加相当于硅胶量2~3倍的水,用力研磨1 min~2 min至成糊状后立即倒于涂布器内,推成5 cm×20 cm,厚度约0.25 mm的薄层板三块。在空气中干燥约15 min后,在100℃活化2 h,取出,放干燥器中保存。一般可保存2 d~3 d,若放置时间较长,可再活化后使用。

33.2.1.2点样

 将薄层板边缘附着的吸附剂刮净,在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点,点距边缘和点间距约为1 cm,点直径约3 mm。在同一块板上滴加点的大小应一致,滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下:

  第一点:0μL AFT B1标准工作液(0.04μg/ mL)。

  第二点:20μL样液。

  第三点:20μL样液+10μL 0.04μg/mL AFT B1标准工作液。

  第四点:20μL样液十10μL 0.2μg/mL AFT B1标准工作液。

33.2.1.3展开与观察

  在展开槽内加10 mL无水乙(yi)醚,预展12 cm,取出挥干。再于另一展开槽内加10 ml丙酮-三氯(lv)甲烷(8+92),展开10 cm~12 cm,取出。在紫外光下观察结果,方法如下。

  由于样液点上加滴AFT B1标准工作液,可使AFT B1标准点与样液中的AFT B1荧光点重叠。如样液为阴性,薄层板上的第三点中AFT B10.0004μg,可用作检查在样液内AFT B1 最(zui)低检出量是否正常出现:如为阳性,则起定性作用。薄层板上的第四点中AFT B10.002μg,主要起定位作用。

  若第二点在与AFT B1,标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点,表示试样中AFT B1含量在5μg/kg以下,如在相应位置上有蓝紫色荧光点,则需进行确证试验。

33.2.1.4确证试验

  为了证实薄层板上样液荧光系由AFT B1产生的,加滴三氟乙(yi)酸,产生AFT B1的衍生物,展开后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。

  第一点:0.04μg/mL AFT B1标准工作液10μL

  第二点:20μL样液。于以上两点各加一小滴三氟乙(yi)酸盖于其上,反应5 min后,用吹风机吹热风2 min后,使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃,再于薄层板上滴加以下两个点。

  第三点:0.04μg/mL AFT B1标准工作液10μL

  第四点:20μL样液。

  再展开(同16.2.1.3),在紫外光灯下观察样液是否产生与AFT B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙(yi)酸的三、四两点,可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。

33.2.1.5稀释定量

  样液中的AFT B1荧光点的荧光强度如与AFT B1标准点的最(zui)低检出量(0.0004μg)的荧光强度一致,则试样中AFT B1含量即为5μg/kg。如样液中荧光强度比最(zui)低检出量强,则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数,直至样液点的荧光强度与最(zui)低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下:

  第一点:10μL AFT B1标准工作液(0.04μg/mL

  第二点:根据情况滴加10μL样液。

  第三点:根据情况滴加15μL样液。

  第四点:根据情况滴加20μL样液。

33.2.1.6结果计算

  试样中AFT B1的含量按式(5)计算:

image.png

  式中:

  X——试样中AFT B1的含量,单位为微克每千克(μg/kg);

  0.000 4——AFT B1的最(zui)低检出量,单位为微克(g);

  V1——加入苯-乙腈混合液的体积,单位为毫升(mL);

  f——样液的总稀释倍数;

  V2——出现最(zui)低荧光时滴加样液的体积,单位为毫升(mL);

  m——加入苯-乙腈混合液溶解时相当试样的质量,单位为克(g);

  1 000——换算系数。

  结果表示到测定值的整数位。

33.2.2双向展开法

  如用单向展开法展开后,薄层色谱由于杂质干扰掩盖了AFT B1的荧光强度,需采用双向展开法。薄层板先用无水乙(yi)醚作横向展开,将干扰的杂质展至样液点的一边而AFT B1不动,然后再用丙酮-三氯(lv)甲烷(8+92)作纵向展开,试样在AFT B1相应处的杂质底色大量减少,因而提高了方法灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂质干扰时,则可改用滴加一点法。

33.2.2.1滴如两点法

33.2.2.1.1点样

  取薄层板三块,在距下端3 cm基线上滴加AFT B1,标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘0.8 cm~1 cm处各滴加10 L AFT B1标准使用液(0.04μg/mL),在距左边缘2.8 cm~3 cm处各滴加20μL样液,然后在第二块板的样液点上加滴10μL AFT B1标准使用液(0.04μg/mL),在第三块板的样液点上加滴10μL 0.2μ/mL AFT B1标准使用液。

33.2.2.1.2展开

33.2.2.1.2.1横向展开:在展开槽内的长边置一玻璃支架,加10 mL无水乙醇,将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开,展至板端后,取出挥干,或根据情况需要时可再重复展开1~2次。

33.2.2.1.2.2纵向展开:挥干的薄层板以丙酮-三氯(lv)甲烷(8+92)展开至10 cm~12 cm为止。丙酮与三氯(lv)甲烷的比例根据不同条件自行调节。

33.2.2.1.3观察及评定结果

  在紫外光灯下观察第一、二板,若第二板的第二点在AFT B1,标准点的相应处出现最(zui)低检出量,而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点,则试样中AFT B1含量在5μg/kg以下。

  若第一板在与第二板的相同位置上出现荧光点,则将第一板与第三板比较,看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFT B1标准点重叠,如果重叠,再进行确证试验。在具体测定中,第一、二、三板可以同时做,也可按照顺序做。如按顺序做,当在第一板出现阴性时,第三板可以省略,如第一板为阳性,则第二板可以省略,直接作第三板。

33.2.2.1.4确证试验

  另取薄层板两块,于第四、第五两板距左边缘0.8 cm~1 cm处各滴加10μL AFT B1,标准使用液(0.04μg/mL)及1小滴三氟乙(yi)酸;在距左边缘2.8 cm~3 cm处,于第四板滴加20μL样液及1小滴三氟乙(yi)酸,于第五板滴加20μL样液、10μL AFT B1标准使用液(0.04μg/mL)及1小滴三氟乙(yi)酸。反应5 min后,用吹风机吹热风2 min,使热风吹到薄层极上的温度不高于40℃。再用双向展开法展开后,观察样液是否产生与AFT B1标准点重叠的衍生物。观察时,可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液AFT B1含量高时,则将样液稀释后,按33.2.1.4做确证试验。

33.2.2.1.5稀释定量

  如样液AFT B1含量高时,按16.3.1.5 稀释定量操作。如AFT B1含量低,稀释倍数小,在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰,影响结果的判断,可将样液再做双向展开法测定,以确定含量。

33.2.2.1.6 果计算

  33.2.1.6

33.2.2.2滴加一点法

33.2.2.2.1点样

  取薄层板三块,在距下端3 cm基线上滴加AFT B1标准使用液与样液。即在三块板臣左边缘0.8cm~1 cm处各滴加20μL样液,在第二板的点上加10μL AFT B1标准使用液(0.04μg/mL)。在第三板的点上加滴10μL AFT B1标准榕液(0.2μg /mL)。

33.2.2.2.2展开

  33.2.2.1.2 的横向展开与纵向展开。

33.2.2.2.3观察及评定结果

  在紫外光灯下观察第一、二板,如第二板出现最(zui)低检出量的黄曲霉霉素B1标准点,而第一板与其相同位置上来出现荧光点,试样中AFT B1含量在5μg/kg以下。如第一板在与第二板AFT B1相同位置上出现荧光点,则将第一板与第三板比较,看第三板上与第一板相同位置的荧光点是否与AFT B1标准点重叠,如果重叠再进行以下确证试验。

33.2.2.2.4确证试验

  另取两板,于距左边缘0.8 cm~1 cm处,第四板滴加20μL样液、1滴三氟乙(yi)酸;第五板滴加20μL样液、10μL 0.04μg/mL AFT B1标准使用液及1滴三氟乙(yi)酸。产生衍生物及展开方法同33.2.2.1。再将以上二板在紫外光灯下观察,以确定样液点是否产生与AFT B1标准点重叠的衍生物,观察时可将第一板作为样液的衍生物空白板。经过以上确证试验定为阳性后,再进行稀释定量,如含AFT B1低,不需稀释或稀释倍数小,杂质荧光仍有严重干扰,可根据样液中黄曲霉毒素B1荧光的强弱,直接用双向展开法定量。

33.2.2.2.5结果计算

  33.2.1.6

 

34精密度

  每个试样称取两份进行平行测定,以其算术平均值为分析结果。

  其分析结果的相对相差应不大于60%

 

35其他

  薄层板上黄曲霉毒素B1的最(zui)低检出量为0.000 4μg,检出限为5μg/kg

 


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