中华人民共和国国家标准
GB 29687-2013
食品安全国家标准
水产品中阿苯达唑及其代谢物多残留的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了水产品中阿苯达唑及代谢物(2-氨基阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜)残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。
本标准适用于水产品中阿苯达唑及代谢物(2-氨基阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜)残留量的测定。
2规范性引用文件
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GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
SC/T 3016水产品抽样方法
3原理
试料中残留的阿苯达唑及代谢物，用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，乙酸乙酯反萃取，高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。
4 试剂和材料
以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1盐酸2-氨基阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑对照品：含量≥99%。
4.2正己烷：色谱纯。
4.3乙腈：色谱纯。
4.4甲醇：色谱纯。
4.5 乙酸乙酯：色谱纯。
4.6 二氯甲烷：色谱纯。
4.7磷酸。
4.8十二水磷酸氢二钠。
4.9庚烷磺酸钠 ：色谱纯。
4.10乙酸铵。
4.11 20%甲醇溶液：取甲醇80 mL，用水溶解并稀释至100 mL。
4.12 0.05 mol/L乙酸铵溶液：取乙酸铵3.85 g，用水溶解并稀释至1 000 mL。
4.13 0.04mol/L庚烷磺酸钠-磷酸溶液：取磷酸2.7mL，加水混匀，加庚烷磺酸钠8.08g，用水溶解并稀释至1 000 mL。
4.14 3%磷酸溶液：取磷酸1.75 mL，用水溶解并稀释至100 mL。
4.15 0.02 mol/L磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠0.716 g，用水溶解并稀释至100 mL，用3%磷酸溶液调节pH至8.5，现配现用。
4.16 100μg/mL阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和2-氨基阿苯达唑砜标准贮备液：精密称取阿苯达唑、阿苯达唑砜和阿苯达唑亚砜各10mg以及盐酸2氨基阿苯达唑砜11.5mg，分别于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100 μg/mL的标准贮备液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。
4.17混合标准工作液：分别精密量取100μg/mL 2-氨基阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜和阿苯达唑标准储备液适量，于同一量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为2-氨基阿苯达唑砜1.0 μg/mL、阿苯达唑亚砜2.0 μg/ mL、阿苯达唑砜0.2 μg/mL以及阿苯达唑5.0 μg/mL的混合标准工作液。2℃~8℃避光保存，有效期1个月。
5仪器与设备
5.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。
5.2分析天平：感量0.000 01 g。
5.3 天平：感量0.01 g。
5.4均质机。
5.5离心机。
5.6旋转蒸发器。
5.7氮吹仪。
5.8梨形瓶：100 mL。
5.9滤膜：有机相，0.45 μm。
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
取适量新鲜或冷冻的鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头、去壳，取肌肉部分。绞碎，并使均质。
——取均质后的供试样品，作为供试试料。
——取均质后的空白样品，作为空白试料。
——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-20℃以下保存。
7测定步骤
7.1虾、蟹类
7.1.1提取
称取试料2 g±0.02 g，于50 mL离心管中，加乙酸乙酯15 mL，均质30 s，振荡5 min，4 000 r/ min离心10 min，取上清液于100 mL梨形瓶中，残渣备用。另取一50 mL离心管，加乙酸乙酯15 mL，清洗均质机30 s，洗涤液于残渣中，振荡5 min，4 000 r/min离心10 min，上清液合并至100 mL梨形瓶中，于35℃旋转蒸发至干，用20%甲醇溶液1.0 mL溶解残渣。
7.1.2除脂
将上述溶液移入10 mL离心管中，再向梨形瓶中加入正己烷1 mL，洗涤，正己烷转入离心管中，振荡1 min，4 000 r/min离心5 min，弃正己烷层液，再加入正己烷1 mL，重复操作两次，取下层液备用。
7.1.3净化
备用液中加0.04 mol/L磷酸1 mL，混匀，加二氯甲烷1.5 mL，混合1 min，4 000 r/ min离心5 min，取二氯甲烷液于10mL离心管中，再加二氯甲烷1.5mL，重复提取两次，合并三次二氯甲烷液于10mL离心管中，于35℃氮气吹千；用0.02 mol/L磷酸氢二钠溶液1.0 mL溶解残余物，加乙酸乙酯2 mL，混合1min，4000r/min离心5min，将乙酸乙酯液移入另一10mL离心管中，再向磷酸氢二钠溶液中加乙酸乙酯2 mL，重复提取两次，合并三次乙酸乙酯液，于40℃氮气吹干，用20%甲醇-水1.0 mL溶解残留物，滤膜过滤，供液相色谱测定。
7.1.4基质匹配标准溶液的制备
称取5份空白试料2g±0.02g，于50mL离心管中，分别加入混合标准工作液0、10、25、100和200 μL，混匀，按提取、除脂、净化步骤操作，基质标准溶液浓度分别为：2-氨基阿苯达唑砜0、0.01、0.025、0.1和0.2μg/mL，阿苯达唑亚砜0、0.02、0.05、0.2和0.4μg/mL，阿苯达唑砜0、0.002、0.005、0.02和0.04μg/mL，阿苯达唑0、0.05、0.125、0.5和1 μg/mL，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
7.2鱼类
7.2.1提取
称取试料2 g±0.02 g，于50 mL离心管中，加乙酸乙酯15 mL，均质30 s， 振荡提取5 min， 4 000 r/min离心10 min，取上清液于100 mL梨形瓶中，残渣备用。另取一50 mL离心管加乙酸乙酯15mL，清洗均质机30s，将此液倒入上述残渣中振荡提取5min，4000r/min离心10min，上清液合并至100 mL梨形瓶中，于35℃减压旋转蒸发至千，加入20%甲醇溶液1.0 mL溶解残渣。
7.2.2除脂
将上述溶液移入10 mL离心管中，再向梨形瓶中加入正己烷1 mL，洗涤，正己烷转入离心管，振荡1 min，4 000 r/min离心5 min，去除正己烷层，再加入正己烷1 mL，依法重复操作两次。下层溶液过0.45μm有机相滤膜，供液相色谱测定。
7.2.3混合基质标准溶液的制备
称取5份空白试料2g±0.02g，于50mL离心管中，分别加混合标准工作液10、25、100和200μL，混匀按提取、除脂步骤操作，基质标准溶液浓度分别为：2-氨基阿苯达唑砜0、0.01、0.025、0.1和0.2μg/mL，阿苯达唑亚砜0、0.02、0.05、0.2和0.4μg/mL，阿苯达唑砜0、0.002、0.005、0.02和0.04μg/mL，阿苯达唑0、0.05、0.125、0.5和1 μg/ mL，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
7.3测定
7.3.1色谱条件
7.3.1.1色谱柱：C18(150 mm×4.6 mm，粒径5μm )，或相当者。
7.3.1.2检测波长：激发波长：290 nm，发射波长：320 nm。
7.3.1.3柱温：30℃。
7.3.1.4流速：1.0 mL/ min。
7.3.1.5进样量：30 μL。
7.3.1.6流动相：梯度程序见表1。
7.3.2测定法
取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜和2-氨基阿苯达唑砜响应值应在仪器检测的线性范围之内。
在上述色谱条件下，标准溶液和空白组织添加试样溶液的高效液相色谱图分别见附录A。
7.4空白试验
除不加试料外，采用完（wan）全相同的步骤进行平行操作。
8结果计算和表述
试料中阿苯达唑及代谢物残留量按式(1)计算：
式中：
X——供试试料中相应的阿苯达唑及代谢物残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
cS——基质标准溶液中相应的阿苯达唑及代谢物标准溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
A——试样溶液中相应的阿苯达唑及代谢物峰面积；
V——样品定容体积，单位为毫升(mL)；
As——基质标准溶液中相应的阿苯达唑及代谢物标准溶液的峰面积；
m——供试试料质量，单位为克(g)。
注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
9方法灵敏度、准确度和精密度
9.1 灵敏度
本方法检测限：阿苯达唑为10μg/kg，2氨基阿苯达唑砜为2.5μg/kg，阿苯达唑亚砜为5 μg/kg，阿苯达唑砜为0.5 μg/kg。
本方法定量限：阿苯达唑为25μg/kg，2氨基阿苯达唑砜为5μg/kg，阿苯达唑亚砜为10μg/kg，阿苯达唑砜为1 μg/kg。
9.2准确度
本方法阿苯达唑在25μg/kg~-500μg/kg、2氨基阿苯达唑砜在5μg/kg~ 100μg/kg、阿苯达唑亚砜在10μg/kg~200μg/kg以及阿苯达唑砜在1μg/kg~20μg/kg添加浓度水平上的回收率为70%~110%。
9.3精密度
本方法批内相对标准偏差≤15% ，批间相对标准偏差≤15%。
