GB/T 36858-2018 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法

更新时间:2023-09-12      点击次数:305

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中华人民共和国国家标准

GB/T 36858-2018

饲料中黄曲霉毒素B1的测定

高效液相色谱法

Determination of aflatoxin B1 in feeds-

High performance liquid chromatography

 

  警示——黄曲霉毒素B1是高致癌物质,应小心处理,分析操作过程应在通风橱内或指定区域内进行。分析过程中,操作者应采取相应的防护措施。分析过程结束后,接触过的器皿及黄曲霉毒素B1溶液应使用浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡过夜。

 

1范围

  本标准规定了测定饲料中黄曲霉毒素B1的高效液相色谱法。

  本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中黄曲霉毒素B1的测定。

  本方法的检出限为0.5μg/kg,定量限为2.0μg/kg

 

2规范性引用文件

  下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包据所有的修改单)适用于本文件。

  GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

  GB/T 14699.1 饲料 采祥

  GB/T 20295动物饲料 试样的制备

 

3原理

  试样中的黄曲霉毒素B1经黄曲霉毒素B1提取溶液提取后,再经三氯甲烷萃取、三氟乙酸衍生, 衍生后的黄曲霉毒素B1采用反相高效液相色谱-荧光检测器进行测定,外标法定量。

 

4试剂或材料

  除非另有规定,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。

4.1水:符合GB/T 6682中规定的一级用水。

4.2甲醇:色谱级。

4.3 乙腈:色谱级。

4.4三氯甲烷。

4.5黄曲霉毒素 B1提取溶液:量取84 mL乙腈,加入到16 mL水中,混匀。

4.6黄曲霉毒素B1衍生溶液:分别量取20 mL三氟乙酸,加入70 mL水中,混匀后加入10 mL冰乙酸,混匀。临用现配。

4.7流动相:分别量取20mL甲醇、10mL乙腈和70mL水,混匀。经0.22μm有机滤膜过滤后备用。

4.8黄曲霉毒素B1标准储备溶液(1000μg/mL):精确称取黄曲霉毒B1对照品纯度≥98%10.0 mg,用10 mL乙腈完全溶解,配制成黄曲霉毒素B1含量为1 000μg/ mL的标准储备溶液,-20℃保存,有效期为6个月。或有证标准溶液。

4.9黄曲霉毒素B1标准工作溶液:取1.0 mL黄曲霉毒素B1标准储备溶液,用乙腈定容至100 mL,浓度为10μg/mL。再取此稀释液1.0 mL,用乙腈定容至100 mL,则浓度稀释为100 ng/mL的标准工作溶液。

4.10黄曲霉毒素B1标准系列溶液:将黄曲霉毒素B1标准工作溶液用乙睛分别稀释成1 ng/mL

2 ng/mL5ng/mL10ng/mL20ng/mL50ng/mL100ng/mL的标准系列溶液。临用现配。

4.11有机滤膜:直径 50mm,孔径0.22μm

4.12针头式过滤器:有机型,孔径0.22μm

4.13乙腈水溶液(90+10):量取 90 mL乙腈,加入到10 mL水中,混匀。

 

5仪器设备

5.1 高效液相色谱仪:配备荧光检测器。

5.2分析天平:感量为 0.01 mg

5.3溶剂过滤器:规格 1 000 mL

5.4 氮吹仪。

5.5恒温振荡器。

5.6旋涡混合仪。

5.7超声波清洗仪。

5.8水浴锅。

 

6样品

  GB/T 14699.1规定采集有代表性的试样,按照GB/T 20195规定将试样粉碎,过0.42 mm分析筛,混匀后装入密闭容器中,备用。

 

7试验步骤

7.1 试样处理

  平行做两份试验。称取5.00 g(精确到0.01 g)试样置于100 mL带塞锥形瓶中,加入25.0 mL黄曲霉毒素B1提取溶液(4.5),室温下200 r/min 振荡提取60 min,用中速滤纸过滤,取10.0 mL滤液于50 mL具塞离心管中,加入10.0 mL三氯甲烷(4.4)萃取,旋涡混合1 min,静置分层后,取下层萃取液于15 mL具塞离心管中,50℃水浴氮气吹干。加入200μL乙腈水溶液(4.13)复溶,然后加入 700μL 黄曲霉毒素B1衍生溶液(4.6 ,加塞混匀,40℃下恒温水浴街生反应75 min后,经0.22μm微孔滤膜过滤后,待测。

7.2 标准系列

  分别取0.9 mL黄曲霉毒素B1标准系列溶液(4.10)于710 mL具塞离心管中,50℃水浴氮气吹干,用200μL乙腈水溶液(4.13)复溶,然后加700μL黄曲霉毒素B1衍生溶液(4.6),加塞混匀,40℃下恒温水浴術生反应75 min,再经0.22μm微孔滤膜过滤后,待测。

7.3 高效液相色谱参考条件

  色谱柱:C18色谱柱250 mm内径4.6 mm粒径5μm;或性能相当者。

流动相(4.7)。

流速:1 mL/min

激发波长:365 nm;发射波长:440 nm

柱温:30℃。

进样体积:20μL

7.4 测定

  在上述液相色谱参考条件下,将衍生后的黄曲霉毒素B1标准系列溶液、试样溶液注入高效液相色谱仪,测定相应的响应值(峰面积),采用单点或多点校正,外标法定量。黄曲霉毒素B1标准溶液色谱图参见附录A

 

8试验数据处理

  试样中黄曲霉毒素B1的含量以质量分数ω表示,单位为微克每千克(μg/kg),按式(1)计算:

image.png

式中:

ρ——试样衍生液在标准曲线上对应的黄曲霉毒素B1含量,单位为纳克每毫升(ng/mL);

V1——提取液的总体积,单位为毫升(mL);

V2——用于萃取的提取液体积,单位为毫升(mL);

m——试样的质量,单位为克(g);

0.9——衍生后的试样溶液体积,单位为毫升(mL)。

以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果,结果保留至小数点后一位。

 

9精密度

  在重复性条件下,两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值,不大于该平均值的20%


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