中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4184-2022
蜜蜂中57 种农药及其代谢物残留量的测定
液相色谱质谱联用法和气相色谱-质谱联用法
Determination of 57 pesticides and their metabolites residues in honeybee-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-tandem mass spectrometry method
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。
本文件起草单位：农业农村部农药检定所、中国农业科学院蜜蜂研究所。
本文件主要起草人：张金振、袁善奎、周欣欣、朱梓豪、赵文、陈朗、周艳明、韩平、毛连纲、蓝帅、刘伟。
1范围
本文件规定了蜜蜂中57种农药及其代谢物残留量的液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用测定方法。
注：57种农药及其代谢物的种类见附录A。
本文件适用于蜜蜂中57种农药及其代谢物残留量的测定。
2范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义
4原理
试样用乙腈提取，提取液经分散固相萃取净化。液相色谱-质谱联用仪和气相色谱-质谱联用仪测定，外标法定量。
5试剂和材料
以下所用试剂，除非另有说明，均为分析纯，水为符谷GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1 甲醇（CH3OH，CAS号67-56-1）色谱纯。
5.1.2乙腈（CH3CN，CAS 号：75-05-8）色谱纯
5. 1.3乙酸乙酯（CH3COOC2H5，CAS号：141-78-6）色谱纯。
5.1.4 甲酸（HCOOH，CAS号：64-18-6）：优级纯。
5.1.5 乙酸铵（CH3COONH，CAS号：631-61-8）：优级纯。
5.1.6氟化铵（NH4F，CAS 号：12125-01-8）：优级纯。
5.1.7 无水硫酸镁（MgSO4，CAS号：7487-88-9）。
5.1.8 氯化钠（NaCl，CAS号：7647-14-5）。
5.1.9 柠檬酸钠（C6H5Na3O7，CAS号：6132-04-3）。
5.1.10 柠檬酸氢二钠（C6H8Na2O8，CAS号：6132-05-4）。
5.2 溶液配制
5.2.1 5 mol/L乙酸铵溶液：称取38.5 g乙酸铵，加水溶解并定容至100 mL。
5.2.2 500 mmol/L氟化铵溶液：称取1.9 g氟化铵，加水溶解并定容至100 mL。
5.3 标准品
57种农药及其代谢物：纯度≥95%。
5.4标准溶液配制
5.4.1标准储备液（1 000 mg/L） ：准确称取10 mg（精确至0.01 mg）各农药标准品，农药标准品的相关信息见附录A。根据标准品的溶解度选择甲醇、丙酮或乙腈等溶剂溶解并定容至10 mL，避光-18℃保存，有效期6个月。
5.4.2混合标准储备液（10 mg/L）：吸取一定量的农药标准储备液（5.4.1）于容量瓶中用乙腈定容至刻度，避光-18℃保存，有效期6个月。
5.4.3混合中间液（1 mg/L）：吸取一定量的混合标准储备液（5.4.2）于容址瓶中，用乙腈定容至刻度，避光-18℃保存，有效期1个月。
5.5 材料
5.5.1 乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）：40μm~60μm，60A。
5.5.2封端的十八烷基碓烷键合硅胶（C18）：40μm~60μm，60A。
5.5.3惰化处理陶瓷均质子：2 cm（长）×1 cm（外径）。
5.5.4 PTFE滤膜（水相有机相兼容）：0.22μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI）。
6.2 气相色谱-质谱联用仪：配电子轰击源（EI）。
6.3 分析天平：感量0.01 mg和0.01 g。
6.4涡旋振荡器。
6.5冷冻离心机：转速不低于9 000 r/min。
6.6 研磨机。
6.7氮吹仪。
6.8 具塞离心管：10 mL、15 mL、50 mL。
7试样的制备和保存
将蜜蜂样品称重并计数，在干冰或液氮等冷冻条件下放入研磨机充分研磨，并置于-18℃条件下保存备用。在试样制备过程中应防止样品污染或残留物含量发生变化。
8分析步骤
8.1 提取
称取5 g试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL水及1颗陶瓷质子（5.5.3）涡旋混匀1 min，静置30 min。加入10 mL乙腈（5. 1. 2）涡旋混匀1 min，于-18℃冷冻30 min降温，再加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠、0.5g柠檬酸氢二钠，剧烈振荡1min，于4℃，9000r/min离心10 min。
8.2净化
称取1.2 g无水硫酸镁（5.1.7）、0.4 g PSA（5.5. 1）及0.4 g C18（5.5.2）于15 mL塑料离心管中，准确吸取7 mL上清液加入其中，涡旋混匀1 min， 于4℃，9 000 r/min离心10 min。准确吸取0.5 mL上清液，加入0.5mL水稀释混匀，过微孔滤膜（5.5.4）待液相色谱质谱联用仪测定。准确吸取1.5mL上清液于10 mL试管中，40℃水浴中氮气吹至近干。加入1 mL乙酸乙酯复溶，过微孔滤膜（5.5.4）待气相色谱-质谱联用仪测定。
8.3 测定
8.3. 1色谱-质谱参考条件
8.3.1.1 A组农药及其代谢物液相色谱串联质谱条件
a） 色谱柱：C18（150 mm×3.0 mm，1.8μm）或相当者；
b）流动相：A 为水溶液（含2 mmol/L乙酸铵，0.05%甲酸），B为甲醇（含0.05%甲酸）；流动相梯度洗脱条件见表1；
表1流动相及梯度洗脱条件
步骤 | 时间min | 流速mL/min | 流动相A% | 流动相B% |
1 | 0 | 0.4 | 80 | 20 |
2 | 3 | 0.4 | 50 | 50 |
3 | 13 | 0.4 | 0 | 100 |
4 | 17 | 0.4 | 0 | 100 |
5 | 17.1 | 0.4 | 80 | 20 |
6 | 23 | 0.4 | 80 | 20 |
c）柱温：40℃；
d）进样量：3μL；
e）电离方式：电喷雾电离；
f）扫描方式：正离于扫描；
g）雾化气：氮气；
h）雾化气压力：35 psi；
i）离子喷雾电压：3500V；
j）干燥器温度：255℃；
k）干燥气流 速：7min；
l）检测方式：动态多反应监测（DMRM）.监测离子难碱撞能见附录B。
8.3.1.2 B组农药及其代谢物液相色谱-串联质谱条件
a）色谱柱：C8（100mm×2. 1mm，2.7μm）或相当者
b） 流动相：A为水溶液（含有5 mmol/L乙酸铵，0.1%甲酸），B为乙腈（含有5mmol/L乙酸铵，10%水，01%甲酸）流动相梯度洗脱条件见表2；
表2流动相及梯度洗脱条件
步骤 | 时间min | 流速mL/min | 流动相A% | 流动相B% |
1 | 0 | 0.3 | 95 | 5 |
2 | 2.5 | 0.3 | 10 | 90 |
3 | 2.6 | 0.3 | 5 | 95 |
4 | 7.5 | 0.3 | 5 | 95 |
5 | 8 | 0.3 | 95 | 5 |
6 | 13 | 0.3 | 95 | 5 |
c）柱温：40℃；
d）进样量：25μL；
e）电离方式：电喷雾电离；
f）扫描方式：正离子扫描；
g）雾化气：氮气；
h）雾化气压力：30 psi；
i）离子喷雾电压：4 000 V；
j）干燥器温度：200℃；
k）干燥气流速：7 L/min；
l）检测方式：多反应监测（MRM），监测离子对、碰撞能见附录B。
8.3.1.3 C组农药及其代谢物液相色谱-串联质谱条件
a）色谱柱：C18（100mm×2.1mm，3.5μm）或相当者；
b）流动相：A 为水溶液（含0.5 mmol/L氟化铵），B为甲醇，流动相梯度洗脱条件见表3；
c）柱温：40℃；
d）进样量：5μL；
e）电离方式：电喷雾电离；
[）扫描方式：负离子扫描；
g）雾化气：氮气；
h）雾化气压力：35 psi；
i）离子喷雾电压：3 500 V；
j）干燥器温度：250℃；
k）干燥气流速：7 L/min；
I）检测方式：多反应监测（MRM），监测离子对、碰撞能见附录B。
8.3.1.4 D组农药及其代谢物气相色谱-串联质谱条件
a）色谱柱：5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷石英毛细管柱：30m×250μm×0.25μm，或相当者；
b）色谱柱温度：初始温度为50℃保持1 min，然后以25℃/min程序升温至125℃，再以10℃/min升温至300℃，保持5min；
c）载气：氦气，纯度≥99.999% ，流速：1.0 mL/min；
d）进样口温度：250℃；
e）进样量：1μL；
f）进样方式：不分流进样；
g）电子轰击源：70 eV；
h）离子源温度：200℃；
i）传输线温度：300℃；
j）溶剂延迟：4 min；
k）检测方式：多反应监测（MRM），监测离子对、碰撞能见附录B。
8.3.2标准工作曲线
空白样品按照8.1~8.2条进行前处理，得到空白基质溶液，精确吸取一定量的混合中间液（5.4.3），逐级用空白基质溶液稀释成质量浓度为2.5×10-4 mg/L~0.05 mg/L的基质匹配标准工作液，根据化合物在仪器上的响应，选择至少5个浓度点，以基质匹配标准工作液浓度为横坐标、定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
8.3.3定性及定量
8.3.3.1定性测定
在相同的实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准溶液相对误差在±2.5%，而且所选择的相对离子丰度与质量浓度相当的基质标准溶液相比.其允许偏差不超过表4规定的范围，则可判断样品中存在目标化合物。
8.3.3.2 定量测定
将混合基质标准工作液和试样溶液依次注入液相色谱质谱联用仪和气相色谱质谱联用仪中，测得定量离子峰面积，并使待测试样中农药及其代谢物的响应值均在仪器的线性范围内，如果超过线性范围，应用空白基质溶液进行适当稀释后测定。采用标准曲线或单点法定量计算。
8.4平行试验
按上述步骤对同一试样进行平行试验。
8.5空白试验
除不加试样外，按上述步骤进行试验。
9结果计算
9.1农药及其代谢物质量分数
试样中农药及其代谢物的含量以质量分数ω计，单位为毫克每千克（mg/kg） ，按公式（1）或公式（2）计算。
式中：
ω——试样中被测物残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
ρS——标准溶液目标化合物的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
Ai——试样溶液中目标化合物的峰面积；
AS——标准溶液中目标化合物的峰面积；
V——定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）；
1 000——换算系数
式中：
ω——试样中被测物残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
ρi——由标准曲线得出的试样溶液中目标化合物的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V——定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）；
1000——换算系数。
注：计算结果保留2位有效数字。含量超过1 mg/kg时，保留3位有效数字。
9.2蜜蜂个体平均残留量
试样中农药及其代谢物的含量以蜜蜂个体平均残留量I计，单位为微克每只蜜蜂（μg/只），按公式（3）计算。
式中：
I——蜜蜂个体平均残留量，单位为微克每只蜜蜂（μg/只）；
ω——试样中被测物残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
n——每克蜜蜂试样的数量，单位为蜜蜂数每克（只/g）；
1 000——换算系数。
10精密度
在重复性条件下，2次独立测定结果的绝对差不大于重复性限（r），见附录D。
在再现性条件下，2次独立测定结果的绝对差不大于再现性限（R），见附录D。
11 定量限
方法的定量限见附录A。
