中华人民共和国国家标准
GB 5009.290-2023
食品安全国家标准 食品中维生素K2的测定
1范围
本标准规定了食品中四烯甲萘醌、七烯甲萘醌、九烯甲萘醌含量的液相色谱测定方法。
本标准适用于乳及乳制品、特殊膳食用食品、发酵豆制品和肉及肉制品中四烯甲萘醌、七烯甲萘醌、九烯甲萘醌三种维生素K2分型的测定。
2原理
试样经脂肪酶、淀粉酶或蛋白酶酶解，采用正己烷提取四烯甲萘醌、七烯甲萘醌、九烯甲萘醌，提取液浓缩后经反相液相色谱分离，锌还原柱柱后衍生，荧光检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.2无水乙醇（C2H6O）。
3.1.3正己烷（C6H14）。
3.1.4碳酸钾（K2CO3）。
3.1.5二氯甲烷（CH2Cl2）：色谱纯。
3.1.6四氢呋喃（C4H8O）：色谱纯。
3.1.7冰乙酸（C2H4O2）。
3.1.8氯化锌（ZnCl2）。
3.1.9无水乙酸钠（C2H3O2Na）。
3.1.10磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.11淀粉酶：（CAS号：9000-92-4）酶活力≥4 000 U/g。
3.1.12脂肪酶：（CAS号：9001-62-1）酶活力≥40 U/g。
3.1.13蛋白酶：（CAS号：9001-73-4）酶活≥6000 U/mg。
3.1.14氢氧化钾（KOH）。
3.2试剂配制
3.2.1 400 g/L氢氧化钾溶液：称取20.0g氢氧化钾于100 mL烧杯中，用20 mL水溶解，冷却后，转移至50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，储存于聚乙烯瓶中。
3.2.2磷酸盐缓冲溶液（pH 8.0）：称取54.0g磷酸二氢钾于500 mL烧杯中，用300 mL水溶解，用400 g/L氢氧化钾溶液（3.2.1）调节pH至8.0±0.2，转移至500 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。
3.2.3流动相：称取1.5g氯化锌、0.5 g无水乙酸钠于1 000 mL烧杯中，加入500 mL甲醇、100 mL二氯甲烷（或四氢呋喃）、0.3 mL冰醋酸，转移至1 000 mL容量瓶中，超声溶解后，加甲醇定容至刻度，混匀，用0.22μm滤膜过滤。
注：增加二氯甲烷，可以缩短保留时间，最高不宜超过150mL/L。
3.2.4二氯甲烷甲醇溶液（体积比10+90）：准确吸取二氯甲烷20mL于200mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，混匀。
3.3标准品
3.3.1四烯甲萘醌（MK-4）标准品（C31H40O2，CAS号：863-61-6）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2七烯甲萘醌（MK-7）标准品（C46H64O2，CAS号：2124-57-4）：纯度≥98% ，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.3九烯甲萘醌（MK-9）标准品（C56H80O2，CAS号：523-39-7）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液
3.4.1.1 MK-4标准储备溶液（1.0 mg/mL）：准确称取MK-4标准品25 mg（精确至0.1 mg），用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4）溶解并定容至25 mL，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中，-20℃±2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.1.2 MK-7标准储备溶液（1.0 mg/mL）：准确称取MK-7标准品25 mg（精确至0.1 mg），用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4）溶解并定容至25 mL，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中， -20℃±2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.1.3 MK-9标准储备溶液（0.5 mg/mL）：准确称取MK-9标准品25 mg（精确至0.1 mg），用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4）溶解并定容至50 mL，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中，-20℃±2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.2标准中间溶液
3.4.2.1 MK-4和MK-7混合标准中间溶液（10μg/mL）：分别准确吸取MK-4、MK-7标准储备溶液0.50 mL于50 mL容量瓶中，用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4）稀释并定容至刻度，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中， -20℃±2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.2.2 MK-9标准中间溶液（50μg/mL）：准确吸取MK-9标准储备溶液5.00mL于50mL容量瓶中，用二氯甲烷甲醇溶液（3.2.4）稀释并定容至刻度，混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中， -20℃±2℃避光保存，保存期限为6个月。
3.4.3标准工作溶液
分别准确吸取MK-4、MK-7混合标准中间溶液0.025 mL、0.050 mL、0.10 mL、0.30 mL、0.50 ml、1.0mL于10mL容量瓶中，准确吸取MK-9标准中间溶液0.010mL、0.020mL、0.040mL、0.060mL、0.10 mL、0.20 mL于上述10 mL容量瓶中，用流动相（3.2.3）定容至刻度，混匀。得到MK-4、MK-7标准工作溶液质量浓度分别为0.025μg/mL、0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.30μg/mL、0. 50μg/mL、1.0μg/mL，MK-9标准工作溶液质量浓度分别为0.050μg/ mL、0.10μg/ mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL。临用现配。
注：MK-7.MK-9低温高浓度时易过饱和，出现浑浊，可提高溶解温度至40℃±2℃超声，至完全溶解，恢复室温使用；所称取的标准品质量是折合纯标准品的质量。
3.5材料
一次性微孔滤膜：0.22μm，有机相。
4仪器和设备
4.1液相色谱仪：配有 荧光检测器。
4.2电子天平：感量分别为0.1 g、1 mg和0.01 mg。
4.3水平振荡器。
4.4涡旋混合器。
4.5高速离心机（转速≥6 000 r/min）。
4.6恒温水浴锅。
4.7 旋转蒸发仪。
4.8氮气浓缩装置。
4.9 pH计：精确至0.1。
4.10组织粉碎机。
4.11均浆器。
4.12超声波清洗器。
5分析步骤
5.1试样制备
质地均匀的粉末类样品测定前充分混匀；肉与肉制品取可食部分粉碎均质；其他固体、半固体样品粉碎均质。液态样品测定前混匀。
注：处理过程尽可能避光操作，制备成均匀试样后，避光尽快检测。
5.2试样处理
警示：处理过程应避免紫外光直接照射，尽可能避光操作。
5.2.1酶解
5.2.1.1乳及乳制 品和特殊膳食用食品
称取混匀后的粉末试样50 g（精确至0.1 g）（m1）至250 mL烧杯中，加入100 mL水，记录加水后的溶液质量（m2），充分混匀溶解；准确称取制备后的溶液6 g（精确至0.001 g）（m3）于50 mL离心管中，加入水11 mL，再加入磷酸盐缓冲液（3.2.2）5 mL，混匀，于50℃±2℃水浴超声15 min， 冷却至室温后，加入脂肪酶0.5 g，再加淀粉酶0.2 g，加盖，涡旋2 min~3 min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解2 h以上（每30 min涡旋1 min）， 使其充分酶解。
液体样品，称取混匀样品1 g~10g （精确至0.001 g） （m，）于50 mL离心管中，加水至15 mL；提取液加入磷酸盐缓冲液（3.2.2）5 mL，混匀，于50℃±2℃水浴超声15 min，冷却至室温后，加入脂肪酶0.5g，再加淀粉酶0.2 g，加盖，涡旋2 min~3 min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解2 h以上（每30min涡旋1min），使其充分酶解。
5.2.1.2发酵豆制品
称取均质后的试样50g（精确至0.1g）（m）至250mL烧杯中，加入100mL水，记录加水后的溶液质量（m2），匀浆器匀浆后，立即准确称取匀浆试样3g（精确至0.001 g）（m3）于50 mL离心管中，加入水13 mL，加入磷酸盐缓冲液（3.2.2）5 mL，混匀，于50℃±2℃水浴超声15 min，冷却至室温后，加入脂肪酶0.2 g，加入蛋白酶0.1 g，加盖，涡旋2 min~3 min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解4 h以上（每30 min涡旋1 min），使其充分酶解。
5.2.1.3肉及肉制品
称取均质后的试样50g（精确至0.1 g）（m1）至250 mL烧杯中，加入100 mL水，记录加水后的溶液质量（m2），匀浆器匀浆后，立即准确称取匀浆试样15 g （精确至0.001 g）（m3）于50 mL离心管中，加入水5 mL，加入磷酸盐缓冲液（3.2.2）5 mL，混匀，于50℃±2℃水浴超声15 min，冷却至室温后，加入脂肪酶0.2 g，加入蛋白酶0.1 g，加盖，涡旋2 min~3 min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解4h以上（每30min涡旋1min），使其充分酶解。
5.2.2提取
取出酶解好的试样，分别加入10 ml无水乙醇及1.0 g碳酸钾，混匀后加入10 ml正己烷，3000 r/min涡旋2 min~3 min或≥250 r/min振荡提取10 min，以6 000 r/min离心5 min，转移上清液至100 mL旋蒸瓶中。
注：为保证提取完全，必要时可向下层溶液中再加入10 mL正己烷，重复操作1次，合并上清液至上述旋蒸瓶中。
5.2.3浓缩
将上述正己烷提取液于40℃±2℃水浴旋蒸至干（如有残液，可用氮气轻吹至干），用5.0 mL流动相（3.2.3）充分溶解浓缩物，将此溶解液用0.22μm滤膜过滤，此滤液为制备的试样溶液。
注：浓缩氮吹后，如果样品浓缩物常温不易溶解，可提高溶解温度至40℃±2℃，至完全溶解。纳豆等MK-7含量高的样品，可适当加大（5.2.3）定容体积，使制备的试样溶液浓度在标准曲线范围内。
5.3 仪器参考条件
5.3.1色谱柱：C18（5μm，4.6 mm×150 mm）或具有同等性能的色谱柱。
5.3.2锌还原柱：4.6 mm×50 mm（填料：锌粉，锌粉平均粒径70μm。锌粉还原柱可直接购买商品柱，此锌粉还原柱连接于色谱柱后）。
5.3.3荧光检测器：激发波长为326 nm，发射波长为410 nm。
5.3.4流动相：等度洗脱（按3.2.3 配制）。
5.3.5流 速：0.8 mL/ min。
5.3.6进样量：20μL。
5.3.7标准溶液的色谱图见附录A中图A.1。
5.4标准曲线的制作
分别将MK-4、MK-7、MK-9标准系列溶液按照浓度由低到高的顺序注入液相色谱仪中，以测得的峰面积为纵坐标，以MK-4、MK-7、MK-9各组分含量（μg/mL）为横坐标，制作标准曲线。
5.5 试样溶液的测定
将制备的试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到制备的试样溶液中MK-4、MK-7、MK-9各组分的含量（μg/mL）。
6分析结果的表述
固体、半固体试样的质量（ms）按公式（1）计算。
式中：
ms——试样的质量，单位为克（g）；
m1——均质样品的质量，单位为克（g）；
m3——称取的匀浆混合样品的质量，单位为克（g）；
m2——均质加水后的溶液的质量，单位为克（g）。
试样中维生素K2各组分的含量X （MK-4、MK-7、MK-9）按公式（2）计算。
式中：
Xi——试样中维生素K2各组分的含量（分别是XMK-4、XMK-7、XMK-9），单位为微克每千克（μg/kg）；
c——试样溶液中维生素K2各组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——试样溶液的体积，单位为毫升（ mL）；
f——试样的稀释倍数；
ms——试样的质量，单位为克（g）；
1 000——换算系数。
计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
8其他
当试样的质量（ms）为2g时，四烯甲萘醌（MK-4）方法检出限为70.0μg/kg，定量限为200μg/kg；七烯甲萘醌（MK-7）方法检出限为70.0μg/kg，定量限为200μg/kg； 九烯甲萘醌（MK-9）方法检出限为160μg/kg，定量限为510μg/kg。
