GB 5009.290-2023 食品安全国家标准 食品中维生素K2的测定

更新时间:2023-10-25      点击次数:289

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中华人民共和国国家标准

GB 5009.290-2023

食品安全国家标准 食品中维生素K2的测定

 

 

1范围

  本标准规定了食品中四烯甲萘醌、七烯甲萘醌、九烯甲萘醌含量的液相色谱测定方法。

  本标准适用于乳及乳制品、特殊膳食用食品、发酵豆制品和肉及肉制品中四烯甲萘醌、七烯甲萘醌、九烯甲萘醌三种维生素K2分型的测定。

 

2原理

  试样经脂肪酶、淀粉酶或蛋白酶酶解,采用正己烷提取四烯甲萘醌、七烯甲萘醌、九烯甲萘醌,提取液浓缩后经反相液相色谱分离,锌还原柱柱后衍生,荧光检测器检测,外标法定量。

 

3试剂和材料

  除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1试剂

3.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。

3.1.2无水乙醇(C2H6O)。

3.1.3正己烷(C6H14)。

3.1.4碳酸钾(K2CO3)。

3.1.5二氯甲烷(CH2Cl2):色谱纯。

3.1.6四氢呋喃(C4H8O):色谱纯。

3.1.7冰乙酸(C2H4O2)。

3.1.8氯化锌(ZnCl2)。

3.1.9无水乙酸钠(C2H3O2Na)。

3.1.10磷酸二氢钾(KH2PO4)。

3.1.11淀粉酶:(CAS号:9000-92-4)酶活力≥4 000 U/g

3.1.12脂肪酶:(CAS号:9001-62-1)酶活力≥40 U/g

3.1.13蛋白酶:(CAS号:9001-73-4)酶活≥6000 U/mg

3.1.14氢氧化钾(KOH)。

3.2试剂配制

3.2.1 400 g/L氢氧化钾溶液:称取20.0g氢氧化钾于100 mL烧杯中,用20 mL水溶解,冷却后,转移至50mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀,储存于聚乙烯瓶中。

3.2.2磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0):称取54.0g磷酸二氢钾于500 mL烧杯中,用300 mL水溶解,用400 g/L氢氧化钾溶液(3.2.1)调节pH8.0±0.2,转移至500 mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀。

3.2.3流动相:称取1.5g氯化锌、0.5 g无水乙酸钠于1 000 mL烧杯中,加入500 mL甲醇、100 mL二氯甲烷(或四氢呋喃)、0.3 mL冰醋酸,转移至1 000 mL容量瓶中,超声溶解后,加甲醇定容至刻度,混匀,用0.22μm滤膜过滤。

  注:增加二氯甲烷,可以缩短保留时间,最高不宜超过150mL/L

3.2.4二氯甲烷甲醇溶液(体积比10+90):准确吸取二氯甲烷20mL200mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度,混匀。

3.3标准品

3.3.1四烯甲萘醌(MK-4)标准品(C31H40O2CAS号:863-61-6):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

3.3.2七烯甲萘醌(MK-7)标准品(C46H64O2CAS号:2124-57-4):纯度≥98% ,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

3.3.3九烯甲萘醌(MK-9)标准品(C56H80O2CAS号:523-39-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

3.4标准溶液配制

3.4.1标准储备溶液

3.4.1.1 MK-4标准储备溶液(1.0 mg/mL):准确称取MK-4标准品25 mg(精确至0.1 mg),用二氯甲烷甲醇溶液(3.2.4)溶解并定容至25 mL,混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中,-20℃±2℃避光保存,保存期限为6个月。

3.4.1.2 MK-7标准储备溶液(1.0 mg/mL):准确称取MK-7标准品25 mg(精确至0.1 mg),用二氯甲烷甲醇溶液(3.2.4)溶解并定容至25 mL,混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中, -20℃±2℃避光保存,保存期限为6个月。

3.4.1.3 MK-9标准储备溶液(0.5 mg/mL):准确称取MK-9标准品25 mg(精确至0.1 mg),用二氯甲烷甲醇溶液(3.2.4)溶解并定容至50 mL,混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中,-20℃±2℃避光保存,保存期限为6个月。

3.4.2标准中间溶液

3.4.2.1 MK-4MK-7混合标准中间溶液(10μg/mL):分别准确吸取MK-4MK-7标准储备溶液0.50 mL50 mL容量瓶中,用二氯甲烷甲醇溶液(3.2.4)稀释并定容至刻度,混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中, -20℃±2℃避光保存,保存期限为6个月。

3.4.2.2 MK-9标准中间溶液(50μg/mL):准确吸取MK-9标准储备溶液5.00mL50mL容量瓶中,用二氯甲烷甲醇溶液(3.2.4)稀释并定容至刻度,混匀。将溶液储存于棕色玻璃容器中, -20℃±2℃避光保存,保存期限为6个月。

3.4.3标准工作溶液

  分别准确吸取MK-4MK-7混合标准中间溶液0.025 mL0.050 mL0.10 mL0.30 mL0.50 ml1.0mL10mL容量瓶中,准确吸取MK-9标准中间溶液0.010mL0.020mL0.040mL0.060mL0.10 mL0.20 mL于上述10 mL容量瓶中,用流动相(3.2.3)定容至刻度,混匀。得到MK-4MK-7标准工作溶液质量浓度分别为0.025μg/mL0.050μg/mL0.10μg/mL0.30μg/mL0. 50μg/mL1.0μg/mLMK-9标准工作溶液质量浓度分别为0.050μg/ mL0.10μg/ mL0.20μg/mL0.30μg/mL0.50μg/mL1.0μg/mL。临用现配。

  注:MK-7.MK-9低温高浓度时易过饱和,出现浑浊,可提高溶解温度至40℃±2℃超声,至完全溶解,恢复室温使用;所称取的标准品质量是折合纯标准品的质量。

3.5材料

  一次性微孔滤膜:0.22μm,有机相。

 

4仪器和设备

4.1液相色谱仪:配有 荧光检测器。

4.2电子天平:感量分别为0.1 g1 mg0.01 mg

4.3水平振荡器。

4.4涡旋混合器。

4.5高速离心机(转速≥6 000 r/min)。

4.6恒温水浴锅。

4.7 旋转蒸发仪。

4.8氮气浓缩装置。

4.9 pH计:精确至0.1

4.10组织粉碎机。

4.11均浆器。

4.12超声波清洗器。

 

5分析步骤

5.1试样制备

  质地均匀的粉末类样品测定前充分混匀;肉与肉制品取可食部分粉碎均质;其他固体、半固体样品粉碎均质。液态样品测定前混匀。

  注:处理过程尽可能避光操作,制备成均匀试样后,避光尽快检测。

5.2试样处理

  警示:处理过程应避免紫外光直接照射,尽可能避光操作。

5.2.1酶解

5.2.1.1乳及乳制 品和特殊膳食用食品

  称取混匀后的粉末试样50 g(精确至0.1 g)(m1)至250 mL烧杯中,加入100 mL水,记录加水后的溶液质量(m2),充分混匀溶解;准确称取制备后的溶液6 g(精确至0.001 g)(m3)于50 mL离心管中,加入水11 mL,再加入磷酸盐缓冲液(3.2.25 mL,混匀,于50℃±2℃水浴超声15 min 冷却至室温后,加入脂肪酶0.5 g,再加淀粉酶0.2 g,加盖,涡旋2 min~3 min,混匀后,置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解2 h以上(每30 min涡旋1 min), 使其充分酶解。

  液体样品,称取混匀样品1 g~10g (精确至0.001 g m,)于50 mL离心管中,加水至15 mL;提取液加入磷酸盐缓冲液(3.2.25 mL,混匀,于50℃±2℃水浴超声15 min,冷却至室温后,加入脂肪酶0.5g,再加淀粉酶0.2 g,加盖,涡旋2 min~3 min,混匀后,置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解2 h以上(每30min涡旋1min),使其充分酶解。

5.2.1.2发酵豆制品

  称取均质后的试样50g(精确至0.1g)(m)至250mL烧杯中,加入100mL水,记录加水后的溶液质量(m2),匀浆器匀浆后,立即准确称取匀浆试样3g(精确至0.001 g)(m3)于50 mL离心管中,加入水13 mL,加入磷酸盐缓冲液(3.2.25 mL,混匀,于50℃±2℃水浴超声15 min,冷却至室温后,加入脂肪酶0.2 g,加入蛋白酶0.1 g,加盖,涡旋2 min~3 min,混匀后,置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解4 h以上(每30 min涡旋1 min),使其充分酶解。

5.2.1.3肉及肉制品

  称取均质后的试样50g(精确至0.1 g)(m1)至250 mL烧杯中,加入100 mL水,记录加水后的溶液质量(m2),匀浆器匀浆后,立即准确称取匀浆试样15 g (精确至0.001 g)(m3)于50 mL离心管中,加入水5 mL,加入磷酸盐缓冲液(3.2.25 mL,混匀,于50℃±2℃水浴超声15 min,冷却至室温后,加入脂肪酶0.2 g,加入蛋白酶0.1 g,加盖,涡旋2 min~3 min,混匀后,置于37℃±2℃恒温水浴锅中酶解4h以上(每30min涡旋1min),使其充分酶解。

5.2.2提取

  取出酶解好的试样,分别加入10 ml无水乙醇及1.0 g碳酸钾,混匀后加入10 ml正己烷,3000 r/min涡旋2 min~3 min或≥250 r/min振荡提取10 min,以6 000 r/min离心5 min,转移上清液至100 mL旋蒸瓶中。

  注:为保证提取完全,必要时可向下层溶液中再加入10 mL正己烷,重复操作1次,合并上清液至上述旋蒸瓶中。

5.2.3浓缩

  将上述正己烷提取液于40℃±2℃水浴旋蒸至干(如有残液,可用氮气轻吹至干),用5.0 mL流动相(3.2.3)充分溶解浓缩物,将此溶解液用0.22μm滤膜过滤,此滤液为制备的试样溶液。

  注:浓缩氮吹后,如果样品浓缩物常温不易溶解,可提高溶解温度至40℃±2℃,至完全溶解。纳豆等MK-7含量高的样品,可适当加大(5.2.3)定容体积,使制备的试样溶液浓度在标准曲线范围内。

5.3 仪器参考条件

5.3.1色谱柱:C185μm4.6 mm×150 mm或具有同等性能的色谱柱。

5.3.2锌还原柱4.6 mm×50 mm(填料:锌粉,锌粉平均粒径70μm。锌粉还原柱可直接购买商品柱,此锌粉还原柱连接于色谱柱后)。

5.3.3荧光检测器:激发波长为326 nm,发射波长为410 nm

5.3.4流动相:等度洗脱(按3.2.3 配制)。

5.3.5 速:0.8 mL/ min

5.3.6进样量:20μL

5.3.7标准溶液的色谱图见附录A中图A.1

5.4标准曲线的制作

  分别将MK-4MK-7MK-9标准系列溶液按照浓度由低到高的顺序注入液相色谱仪中,以测得的峰面积为纵坐标,以MK-4MK-7MK-9各组分含量(μg/mL)为横坐标,制作标准曲线。

5.5 试样溶液的测定

  将制备的试样溶液注入液相色谱仪中,得到峰面积,根据标准曲线得到制备的试样溶液中MK-4MK-7MK-9各组分的含量(μg/mL)。

 

6分析结果的表述

  固体、半固体试样的质量(ms)按公式(1)计算。

image.png

  式中:

  ms——试样的质量,单位为克(g);

  m1——均质样品的质量,单位为克(g);

  m3——称取的匀浆混合样品的质量,单位为克(g);

  m2——均质加水后的溶液的质量,单位为克(g)。

  试样中维生素K2各组分的含量X MK-4MK-7MK-9)按公式(2)计算。

image.png

  式中:

  Xi——试样中维生素K2各组分的含量(分别是XMK-4XMK-7XMK-9),单位为微克每千克(μg/kg);

c——试样溶液中维生素K2各组分的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

V——试样溶液的体积,单位为毫升( mL);

f——试样的稀释倍数;

ms——试样的质量,单位为克(g);

1 000——换算系数。

  计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留3位有效数字。

 

7精密度

  在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%

 

8其他

  当试样的质量(ms)为2g时,四烯甲萘醌(MK-4)方法检出限为70.0μg/kg,定量限为200μg/kg;七烯甲萘醌(MK-7)方法检出限为70.0μg/kg,定量限为200μg/kg 九烯甲萘醌(MK-9)方法检出限为160μg/kg,定量限为510μg/kg


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