GB 31659.4-2022食品安全国家标准 奶及奶粉中阿维菌素类药物残留量的测定

中华人民共和国国家标准

GB 31659.4-2022

代替GB/T 22968-2008

食品安全国家标准

奶及奶粉中阿维菌素类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

National food safety standard-

Determination of avermectins residues in milk and milk powder

by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method

前言

  本文件按照GB/T 1.1-2020《 标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

  本文件代替GB/T 22968-2008《牛奶和奶粉中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，与GB/T 22968-2008 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要变化如下：

  ——标准文本格式修改为食品安全国家标准文本格式；

  ——标准范围中增加了羊奶的检测；

  ——标准测定物质改为各药物的残留标志物；

  ——标准灵敏度进一步提高。

  本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：

  ——GB/T 22968-2008。

1范围

  本文件规定了奶及奶粉中阿维菌素类药物残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。

  本文件适用于牛奶、羊奶和奶粉中阿维菌素（以阿维菌素B1a计）、伊维菌素（以22，23-二氢阿维菌素B1a计）、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素（以乙酰氨基阿维菌素B1a计）单个或多个药物的残留检测。

2规范性引用文件

  下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

  GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

  本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

  试料中残留的阿维菌素类药物，用乙腈提取，C18固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，基质匹配标准溶液外标法定量。

5试剂和材料

5.1试剂

  以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

5.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。

5.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。

5. 1.3 甲酸（CH2O2）：色谱纯。

5.1.4三乙胺（C6H15N）。

5.1.5 异辛烷（C8H18）。

5.2 溶液配制

5.2.1 0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸1 mL，用乙腈稀释至1 000 mL。

5.2.2 0.1%甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水稀释至1 000 mL。

5.2.3淋洗溶液：取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 μL，混匀。

5.2.4 50%乙腈溶液：取乙腈50 mL，用水稀释至100 mL。

5.3 标准品

  阿维菌素（Avermectin，C48H72O14·C47H70O14，CAS号：71751-41-2），含量≥98.0%；伊维菌素（Iver-mectin，C48H74O14，CAS号：70288-86-7），含量≥98.0%；多拉菌素（Doramectin，C50H74O14，CAS号：117704-25-3），含量≥94.3%；乙酰氨基阿维菌素（Eprinomectin，C50H75NO14，CAS号：123997-26-2），含量≥98.0%。

5.4 标准溶液的制备

5.4.1 阿维菌素类药物标准储备液：精密称取阿维菌素（以阿维菌素B1a计）、伊维菌素（以22，23-二氢阿维菌素B1a计）、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素（以乙酰氨基阿维菌素B1a计）标准品各约10mg，于不同的10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的阿维菌素B1a、22 ，23-二氢阿维菌素B1a、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素B1a标准储备液。-18℃以下保存，有效期12个月。

5.4.2 阿维菌素类药物标准工作液：精密量取1 mg/mL的阿维菌素B1a、22，23-二氢阿维菌素B1a、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素B1a标准储备液100 μL，于不同的10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL的阿维菌素B1a、22，23-二氢阿维菌素B1a、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素B1a标准工作液。-18℃以下保存，有效期6个月。

5.5 材料

5.5.1 C18固相萃取柱：500 mg/6 mL，或相当者。

5.5.2亲水聚四氟乙烯微孔滤膜：0.22μm。

6仪器和设备

6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。

6.2 分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。

6.3 涡旋混合器。

6.4高速离心机。

6.5 氮吹仪。

6.6 水平振荡器。

7试样的制备与保存

7.1试样的制备

  取适量新鲜或解冻的空白或供试牛奶或羊奶及奶粉，混合均匀。

a）取均质后的供试样品，作为供试试样；

b）取均质后的空白样品，作为空白试样；

c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。

7.2 试样的保存

  牛奶和羊奶：冷藏避光或-18℃以下保存。

  奶粉：阴凉干燥处保存。

8测定步骤

8.1提取

  称取牛奶或羊奶2 g（准确至±0.05 g）或奶粉0.5 g（准确至±0.01 g）于50 mL离心管中，加乙腈8 mL，涡旋后200 r/min水平振荡5 min，8 000 r/min离心8 min，转移上清液至另一50 mL离心管中，加水10 mL、三乙胺25 μL，混匀，备用。

8.2净化与浓缩

  C18固相萃取柱依次用乙腈5 mL和淋洗溶液5 mL活化，取备用液过柱，用淋洗溶液5 mL淋洗，抽干；再用异辛烷5 mL淋洗，抽干；用乙腈5 mL洗脱，收集洗脱液于10 mL试管中，于50℃下氮气吹干。残余物中加入50%乙腈溶液1.0 mL，充分溶解。过微孔滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。

8.3基质匹配标准曲线的制备

  精密量取阿维菌素类标准工作液适量，用50%乙腈水溶液稀释成含阿维菌素B1a、22，23-二氢阿维菌素B1a、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素B1a浓度分别为0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和400 ng/mL 的系列标准工作液（牛奶或羊奶用0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL浓度点，奶粉用2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL和400 ng/mL浓度点），从中各取1.0 mL，分别加入空白试料经提取、净化和吹干后的残余物中，充分溶解，作为基质匹配标准溶液，过微孔滤膜后上机测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

8.4 测定

8.4.1 液相色谱参考条件

  a）色谱柱：C18（50 mm×2.1mm，1.7μm），或性能相当者。

  b）流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液。流动相梯度：0 min~1 min保持70% B；1 min~3 min，70%B线性变化到100%B；3 min~4 min保持100%B；4 min~6 min保持70% B。

  c）流速：0.4 mL/min。

  d）进样量：5 μL。

  e）柱温：30℃。

8.4.2串联质谱参考条件

  a）离子源：电喷雾离子源；

  b）扫描方式：正离子扫描；

  c）检测方式：多反应离子监测（MRM）；

  d）电喷雾电压：5 500 V；

  e）离子源温度：500℃；

  f）辅助气1：50 psi；

  g）辅助气2：50 psi；

  h）气帘气：30 psi；

  i）碰撞气：Medium。

  j）待测药物定性、定量离子对和对应的去簇电压、碰撞能量参考值见表1。

8.4.3 测定法

  试样溶液的保留时间在基质匹配标准溶液保留时间的±2.5%之内。试样溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表2的要求。

  取基质匹配标准溶液和试样溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。基质匹配标准溶液及试样溶液中阿维菌素类药物的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内，超出线性范围时进行适当倍数稀释后再进行分析。基质匹配标准溶液中特征离子质量色谱图见附录A。

表2试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围

单位为百分号

8.5空白试验

  取空白试料，除不添加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

9结果计算和表述

  试样中阿维菌素类药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。

  式中：

  X——试样中阿维菌素类药物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；

  C——基质匹配标准溶液中阿维菌素类药物浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

  A——试样溶液中阿维菌素类药物的峰面积；

  V——溶解残余物所用溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；

  A_S——基质匹配标准溶液中阿维菌素类药物的峰面积；

  m——试样质量的数值，单位为克（g）。

10 检测方法的灵敏度、准确度和精密度

10.1灵敏度

  本方法对牛奶或羊奶的检测限为0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg；对奶粉的检测限为1μg/kg，定量限为4 μg/kg。

10.2 准确度

  本方法牛奶中阿维菌素B1a 在0.5 μg/kg~5 μg/kg、22，23-二氢阿维菌素B1a 在0.5 μg/kg~20 μg/kg、多拉菌素在0.5 μg/kg~ 30 μg/kg、乙酰氨基阿维菌素B1a在0.5 μg/kg~40 μg/kg添加浓度水平上，羊奶中阿维菌素类药物在0.5 μg/kg~5 μg/kg添加浓度水平上，以及奶粉中阿维菌素B1a在4 μg/kg~40 μg/kg、22，23-二氢阿维菌素B1a在4 μg/kg~160 μg/kg、多拉菌素在4 μg/kg~ 240 μg/kg、乙酰氨基阿维菌素B1a在4 μg/kg~320 μg/kg添加浓度水平上的回收率均为60%~ 120%。

10.3 精密度

  本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。