中华人民共和国国家标准
GB 5009.210-2023
食品安全国家标准 食品中泛酸的测定
前言
本标准代替GB 5009.210-2016《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》。
本标准与GB 5009.210-2016相比，主要变化如下：
——增加了液相色谱-串联质谱法；
——修改了微生物法试样的前处理方法，并增加了微孔板测定方法。
1范围
本标准规定了食品中泛酸的测定方法。
本标准第一法适用于婴幼儿配方食品（除特殊医学用途婴儿配方食品外）、婴幼儿辅助食品、乳制品、饮料、营养补充剂中泛酸的测定。
本标准第二法和第三法适用于食品中泛酸的测定。
第一法 液相色谱法
2原理
试样用热水提取后，经C18反相色谱柱分离，以保留时间定性，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1盐酸（HCl）。
3.1.2磷酸（H3PO4）。
3.1.3磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.4七水合硫酸锌（ZnSO4·7H2O）。
3.1.5乙腈（CH3CN）：色谱纯。
3.1.6 a-淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg。
3.2试剂配制
3.2.1盐酸（0.1 mol/L）：吸取8.3 mL盐酸至800 mL水中，加水稀释至1 000 mL，混匀。
3.2.2盐酸（1.0 mol/L）：吸取8.3 mL盐酸至80 mL水中，加水稀释至100 mL，混匀。
3.2.3硫酸锌溶液（0.5 mol/L）：称取14.4 g七水合硫酸锌，加水溶解并稀释至100 mL。
3.2.4磷酸二氢钾溶液（0.02 mol/L）：称取2.722 g磷酸二氢钾，加500 mL水溶解，用磷酸调节pH至3.0±0.1，用水稀释至1 000 mL，用0.45μm 滤膜过滤。
3.3标准品
D-泛酸钙标准品（C18H32CaN2O10，CAS号：137-08-6）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
3.4标准溶液配制
3.4.1泛酸标准储备液（500 μg/mL）：准确称取136 mg D-泛酸钙标准品（精确至0.1 mg） ，加水溶解并转入到250 mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。标准储备液-18℃及以下避光保存，可保存3个月。
3.4.2泛酸标准中间溶液（100μg/mL）：准确吸取标准储备溶液20.0mL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。临用现配。
3.4.3泛酸标准工作溶液：分别准确吸取泛酸标准中间液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、16.0 mL和32.0 mL于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得到浓度分别为1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/ml、16.0μg/mL和32.0μg/mL的泛酸标准工作溶液。临用现配。
4仪器和设备
4.1天平：感量0.1 mg。
4.2恒温振荡水浴箱：振荡频率100 r/min±20 r/min。
4.3超声波振荡器。
4.4 pH计：精度为±0.01。
4.5离心机：转速≥8000 r/min。
4.6 0.45μm滤膜。
4.7高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器。
5分析步骤
5.1试样制备
固态试样粉碎并混合均匀。碳酸饮料需超声波去除二氧化碳，其他液态试样摇匀。
5.2试样提取
5.2.1饮料、营养素补充剂
准确称取或量取适量试样，精确至0.001 g，一般固体试样0.2 g~2 g，液态试样10 g~20 g，置于50mL锥形瓶中，加入约30mL 40℃~50℃温水超声提取20min。转入50mL容量瓶中，用水稀释至刻度并充分混匀后，转入离心管，8 000 r/min离心2 min，取上清液过0.45μm滤膜，滤液待上机测定。
5.2.2 婴幼儿配方食品（除特殊医学用途婴儿配方食品外）、婴幼儿辅助食品、乳制品准确称取适量试样，精确至0.00 1 g，一般固态试样约5 g，液态试样约20 g。置于100 mL锥形瓶中，加入约30 mL 40℃~50℃温水。不含淀粉试样，直接超声提取20 min。含淀粉试样，加入a-淀粉酶0.2 g，振摇混匀，盖上瓶塞，在55℃±5℃水浴条件下振摇酶解30 min，取出试样液，冷却至室温。
用0.1 mol/L 盐酸或1.0 mol/L盐酸调节pH至5.0±0.1，加入5 mL 0.5 mol/L硫酸锌溶液，充分混合。转入50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度并充分混匀后，转入离心管，8000 r/min 离心2 min，取上清液过0.45 μm滤膜，滤液待上机测定。
5.3液相参考色谱条件
液相参考色谱条件如下：
a） 色谱柱：ODS-C18（粒径5μm，250 mm×4.6 mm）或具有同等性能的色谱柱。
b） 柱温：35℃±0.5℃。
c） 检测波长：200 nm。
d） 流动相：0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液乙腈（95+5）。
e） 流速：1.0 mL/min。
f） 进样量：10μL或20μL。
5.4测定
5.4.1标准曲线测定
将泛酸标准工作液依次进行色谱分析（标准色谱图见附录A中图A.1）。以标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4.2试样溶液的测定
将试样测定液进行色谱分析，根据试样峰面积从标准曲线中查得相应的泛酸浓度。
6分析结果的表述
试样中泛酸的含量按式（1）计算。
式中：
X——试样中泛酸含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；
c——从标准曲线得到的试样溶液中泛酸的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——试样测定液总体积，单位为毫升（mL）；
f——试样测定液稀释倍数；
m——试样的取样量，单位为克（g）；
100/1 000——换算系数。
计算结果保留3位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8其他
8.1 对于固体试样，当称样量为5 g，定容至50 mL时，检出限为0.025 mg/100 g，定量限为0.08 mg/100 g。
8.2对于液体试样 ，当取样量为20 g，定容至50 mL时，检出限为0.006 3 mg/ 100 g，定量限为0.02 mg/100 g。
第二法 液相色谱-串联质谱法
9原理
试样经酶解、提取、离心、过滤后，经C18反相色谱柱分离，采用串联质谱多离子反应监测方式检测，稳定同位素稀释内标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1试剂
10.1.1乙睛（CH3CN）：色谱纯。
10.1.2甲酸（HCOOH）：色谱纯。
10.1.3盐酸（HCl）。
10.1.4冰乙酸（C2H4O2）。
10.1.5乙酸锌[Zn（CH3COO）2]。
10.1.6亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]。
10.1.7三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）。
10.1.8碳酸氢钠（NaHCO3）。
10.1.9碳酸氢钾（KHCO3）。
10.1.10甲苯（C7H8）。
10.1.11 a-淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg。
10.1.12阴离子交换树脂：Dowex 1×8粒度38 μm~75 μm。
10.1.13碱性磷酸酶：来源于牛肠粘膜，EC 3.1.3.1，酶活力≥10 U/mg。
10.1.14鸽子肝脏丙酮提取物干粉：酶活力≥0.1 U/g。
10.2试剂配制
10.2.1甲酸溶液（0.1%）：吸取1 mL甲酸，用水稀释至1 000 mL，混匀。
10.2.2乙酸锌溶液（300 g/L）：称取30.0 g乙酸锌，用水溶解并稀释至100 mL。
10.2.3亚铁氰化钾溶液（150 g/L）：称取15.0 g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至100 mL。
10.2.4 Tris缓冲液：称取121.0 g三羟甲基氨基甲烷溶于500 mL水中，用冰乙酸调pH至8.1±0.2，加水稀释至1 000 mL，混匀，贮存于2℃~8℃冰箱中。
10.2.5碳酸氢钠溶液（0.1 mol/L）：称取0.84 g碳酸氢钠，加水溶解并稀释至100 mL，混匀。
10.2.6碱性磷酸酶溶液：称取0.2 g碱性磷酸酶至研钵中，少量多次加水研磨至溶解，用水稀释至10 mL。临用现配，存于2℃~8℃冰箱预冷。
10.2.7盐酸溶液（1 mol/L）：吸取83 mL盐酸到800 mL水中，加水稀释至1 000 mL，混匀。
10.2.8碳酸氢钾溶液（0.02 mol/L）：称取2 g碳酸氢钾，加水溶解并稀释至1 000 mL，混匀。
10.2.9树脂活化：称取100g阴离子交换树脂于2 L锥形瓶中，加入1 L 1 mol/L盐酸溶液，置于振荡器上充分振摇10min，用铺有滤纸的布氏漏斗过滤。将阴离子交换树脂转回锥形瓶，再加入1L 1mol/L盐酸溶液重复振摇10 min、过滤。向阴离子交换树脂加入1 L水振摇洗涤10 min，过滤，重复用水洗涤10次，转移至锥形瓶中。向阴离子交换树脂加入少量水，混匀，逐滴向阴离子交换树脂加入Tris缓冲液，调节pH至8.0±0.1。置于2℃~8℃冰箱保存，2d内使用。
10.2.10鸽子肝脏提 取液：配制此试剂前- - 天将所用容器放入2℃~8℃冰箱中冷藏过夜。称取30 g鸽子肝脏丙酮提取物干粉，放入预冷的研钵中，冰浴条件下分次加入0.02mol/L碳酸氢钾溶液300mL，研磨成匀质混悬液。将混悬液转至预冷的具盖离心管中，盖紧后充分振摇后，放入-20℃冰箱内静置10 min。取出后，3 000 r/min离心5 min，将上清液转至500 mL预冷的广口瓶中。向上清液中加入部分活化树脂（约150 g），放入冰水浴中振摇5 min。倒入预冷离心管中3 000 r/min离心5 min。将上清液移入另一500 mL预冷的广口瓶中，-20℃静置10 min。再加入剩余活化树脂（约150 g） ，放入冰浴中振摇5 min，倒入离心管中，3 000 r/min离心5 min。收集上清液，-20℃静置10 min，分装于预冷的具塞试管中，-20℃冷冻保存，可保存1年。用前预置于2℃~8℃冰箱内化冻并使用。
10.3标准品
10.3.1 D-泛酸钙标准品（C18H32CaN2O10，CAS号：137-08-6）：纯度≥99%，或经国家认证并授子标准物质证书的标准品。
10.3.2 13C6,15N2-泛酸钙（13C6C12H32Ca15N2O10 ，CAS号：356786-94-2）：纯度≥97%。
10.4标准溶液配制
10.4.1泛酸标准储备液（500μg/ mL）：准确称取136 mg D-泛酸钙标准品（精确至0.1 mg），加水溶解并转入到250 mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。标准储备液-18℃及以下避光保存，可保存3个月。
10.4.2泛酸标准中间溶液（10μg/mL）：准确吸取标准储备液1mL于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度。临用现配。
10.4.3内标储备液（50μg/mL）：称取5 mg 13C6,15N2-泛酸钙，加水溶解并转入到100 mL容量瓶中，稀释至刻度。内标储备液- 18℃及以下避光保存，可保存6个月。
10.4.4泛酸标准系列工作液：吸取适量标准中间溶液于25 mL容量瓶中，加入100 μL内标储备液，用水稀释至25 mL，得到泛酸标准工作液浓度分别为10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL、600 ng/ml、1 000 ng/mL和1 500 ng/mL。临用现配。
11 仪器和设备
11.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
11.2 分析天平：感量分别为0.1 mg和0.01 g。
11.3 pH计：精度为±0.01。
11.4 离心机：转速≥8 000 r/ min。
11.5 超声波振荡器。
11.6 压力蒸汽消毒器：121 ℃。
11.7 恒温振荡水浴箱：振荡频率100 r/min±20 r/min。
11.8 涡旋混合器。
12 分析步骤
12.1样品前处理
12.1.1谷薯类、肉蛋类、蔬果类、菌藻类、豆及坚果类等食品
准确称取适量试样（含0.02 mg~0.2 mg泛酸，精确到0.01 g），转入至100 mL锥形瓶中。加入10 mL Tris缓冲液、30 mL水，振荡混匀。于121℃高压条件下水解20 min。冷却至室温，依次加入0.1 mL碳酸氢钠溶液、0.4 mL碱性磷酸酶溶液、0.2 mL鸽子肝脏提取液，混匀后，加100 μL甲苯，具塞。37℃±1℃下以100 r/min±20 r/min振幅恒温振荡8 h~10h。转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，过滤。
移取10.0 mL上述液体于50 mL离心管中，加入100μL内标储备液，加水至20 mL，涡旋10s。分别加入0.4 mL乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，加水至25 mL，涡旋10 s。静置10 min~30 min后，8 000 r/min离心2 min。上清液过 0.22μm尼龙滤膜后进样分析。
12.1.2 婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、特殊医学用途配方食品、乳制品、饮料、营养素补充剂、果冻准确称取5 g固体试样（精确到0.01 g），加水至50 g（精确到0.01 g）。加入a-淀粉酶0.2 g，振摇混匀，盖上瓶塞，在55℃±5℃水浴条件下振摇酶解30 min。称取0.5 g~5.0 g上述液体（精确到0.1 mg），置于50 mL离心管中。液体试样混匀后直接称取0.5 g~5.0 g（精确到0.1 mg），置于50 mL离心管中。
加入100μL内标储备液，加水至20mL，涡旋10s。分别加入0.4mL乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，加水至25 mL，涡旋10 s。静置10 min~30 min后，8 000 r/min离心2 min。上清液过0.22 μm尼龙滤膜后进样分析。
12.2 仪器参考条件
12.2.1液相参考色谱条件
液相参考色谱条件如下：
a）色谱柱：C18，1.8 μm，100 mm×2.1 mm，或相当者。
b）柱温：35℃。
c）流速：0.3 mL/min。
d）进样量：2 μL。
e）流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈。液相色谱梯度洗脱条件见表1。
12.2.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）电离方式：ESI+。
b）毛细管电压：3.0 kV。
c）干燥气温度：400℃。
d）干燥气流速：800 L/h。
e）锥孔反吹气流速：150 L/h。
f）碰撞气为高纯氩。
g）六通阀：0min~2min流动相进废液，2min~7min流动相进质谱。
h）监测方式：MRM，多反应监测。
i）监测离子对、碰撞能量参考条件见表2。
12.3 标准曲线的制作
将标准系列工作液分别注入液相色谱串联质谱仪中，测定相应的泛酸与"C。，I5N2-泛酸钙的峰面积，以标准系列工作液中泛酸的浓度为横坐标，以泛酸的响应值与13C6，15N2-泛酸钙的响应值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。泛酸标准溶液的色谱图参见附录A中图A.2。
12.4试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到泛酸的响应值与13C6，15N2-泛酸钙的响应值的比值，根据标准曲线得到待测液中泛酸的浓度。
12.5定性测定
在相同试验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准品的保留时间相比较，变化范围应在±2.5%之内，并且在样品质谱图中所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相对偏差不超过表3规定的范围。
13分析结果的表述
试样中泛酸的含量按式（2）计算。
式中：
X——试样中泛酸的含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；
——由标准曲线得到的试样溶液中泛酸的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样测定液体积，单位为毫升（mL）；
m——试样的取样量，单位为克（g）；
100/106——换算系数；
f——稀释因子。
计算结果保留3位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15其他
15.1 对于固态试样，当取样量为5 g，定容至25 mL时，本方法检出限为0.025 mg/100 g，定量限为0.05 mg/100 g。
15.2对于液体试样，当取样量为5 g，定容至25 mL时，本方法检出限为0.002 5 mg/100 g，定量限为0.005 mg/100 g。
第三法 微生物法
16原理
泛酸是植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）生长所必需的营养素，在一定可控的条件下培养一段时间后，植物乳植杆菌的生长与泛酸含量呈现一定线性关系。因植物乳植杆菌生长导致的培养液浑浊度的变化可采用分光光度计或酶标仪进行透光率（或吸光度值）测定，根据培养液中泛酸含量与透光率（或吸光度值）拟合曲线方程计算出试样中泛酸的含量。
17试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一-级水。
17.1 试剂
17.1.1 盐酸（ HCI）。
17.1.2 冰乙酸（C2H4O2）。
17.1.3氢氧化钠（NaOH）。
17.1.4氯化钠（NaCl）。
17.1.5碳酸氢钠（NaHCO3）。
17.1.6碳酸氢钾（KHCO3）。
17.1.7三水合乙酸钠（C2H3O2Na·3H2O）。
17.1.8 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）。
17.1.9 甲苯（C7H8）。
17.1.10 阴离子交换树脂Dowex 1×8：粒度38μm~75μm。
17.1.11 a-淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg。
17.1.12木瓜蛋白酶：酶活≥10 U/mg。
17.1.13碱性磷酸酶：来源于牛肠黏膜，EC 3.1.3.1，酶活力≥10 U/mg。
17.1.14鸽子肝脏丙酮提取物干粉：酶活力≥0.1 U/g。
17.2试剂配制
17.2.1生理盐水：称取 9.0 g氯化钠，加水溶解并稀释至1 0000 mL，混匀。临用前于121℃高压灭菌10 min，备用。
17.2.2盐酸溶液：吸取 100 mL盐酸与50倍水混合。
17.2.3乙酸溶液（0.2 mol/L）：吸取1.2 mL冰乙酸，用水稀释至100 mL，混匀。
17.2.4乙酸钠溶液（0.2 mol/L）：称取2.7 g三水合乙酸钠，加水溶解并稀释至100 mL，混匀。
17.2.5氢氧化钠溶液（2 mol/L）：称取8 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100 mL，混匀。
17.2.6乙酸缓冲液（1.0 mol/L，pH3.8）：吸取58 mL冰乙酸加入800 ml水中，用2 mol/L氢氧化钠调节pH至3.8±0.1，加水至1 000 mL，混匀。
17.2.7乙酸缓冲液（1.0 mol/L，pH 4.5）：吸取58 mL冰乙酸加入800 mL水中，用2 mo/L氢氧化钠调节pH至4.5±0.1，加水至1 000 mL，混匀。
17.2.8 Tris缓冲液：同10.2.4。
17.2.9碳酸氢钠溶液（0.1 mol/L）：同 10.2.5。
17.2.10碱性磷酸酶溶液：同10.2.6。
17.2.11鸽子肝脏提取液：同 10.2.10。
17.3 培养基
17.3.1乳酸杆菌琼脂培养基：见附录B中B.1。
17.3.2泛酸测定用培养液：见附录B中B.2。
17.4培养液的配制
见附录B。
17.5 标准品
D-泛酸钙标准品（C18H32Ca2N2O10，CAS号：137-08-6）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
17.6标准溶液的配制
17.6.1泛酸标准储备溶液（400 μg/mL）：精确称取435 mg D-泛酸钙（精确至0.1 mg）， 加水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加10mL 0.2mol/L乙酸溶液、100mL 0.2mol/L乙酸钠溶液，用水定容至刻度。贮存于棕色瓶中，加入200μL甲苯，于2℃~4℃冰箱中可保存2年。
17.6.2泛酸标准中间液（1.00 μg/mL）：准确吸取2.5 mL泛酸标准储备液置于1 000 ml容量瓶中，加入10 mL 0.2 mol/L乙酸溶液、100 mL 0.2 mol/L乙酸钠溶液用水定容至刻度。加入200 μL甲苯，于2℃~8℃冰箱中可保存1年。
17.6.3泛酸标准工作液（ 20.0 ng/mL）：准确吸取2.00 mL泛酸标准中间液，置于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。临用现配。
18 仪器和设备
18.1天平：感量 0.1 mg。
18.2恒温培养箱：36℃±1℃。
18.3 恒温振荡水浴箱：37℃±1℃，振荡频率100 r/ min±20 r/min。
18.4压力蒸汽消毒器：121℃。
18.5涡旋振荡器。
18.6 离心机：转速≥3 000 r/min。
18.7 pH计：精度为±0.01。
18.8 可见分光光度计。
18.9 酶标仪。
18.10 超声波振荡器。
18.11 微孔板（无菌）：0.36 mL，1.1 mL。
注：所有测试试管使用前洗刷干净，沸水浴30 min，沥干后放入盐酸溶液中没泡2 h，经水冲洗后，经170℃±2℃烘干3 h后使用。
19 菌种的制备与保存
19.1 菌种
植物乳植杆菌Lactiplantibacillus plantarum（ATCC 8014），或等效菌株。
19.2储备菌株的制备
无菌操作条件下将菌种植物乳植杆菌-冻干菌粉转接至无菌乳酸杆菌琼脂培养基中，36℃±1℃恒温培养20 h~24 h，使菌种复活。连续传种2次~3次，将培养好的琼脂管作为植物乳植杆菌储备菌株，放入2℃~4℃冰箱中保存。
19.3菌株传代与保存
将植物乳植杆菌储备菌株每月至少传代1次，培养并保存新菌株。
19.4菌株活化
试验前2 d~3 d，将最新保存的菌株接种至无菌琼脂管中，36℃±1℃培养20 h~24 h，以活化菌株，用于接种液的制备。
注：如果新菌株保存时间超过2周，试验前宜连续传种2代~3代以保证细菌活力。
19.5接种液的制备
试验前一天，取2 mL泛酸标准工作液（20 ng/mL）和4 mL泛酸测定用培养液混匀，分装于2支5 mL离心管中，塞好棉塞，121℃下高压灭菌15 min，冷却至室温，此即种子培养液。
用接种环将活化菌株接种至种子培养液中，36℃±1℃培养20 h~24h。取出离心管，3000 r/min离心10min，弃去上清液。无菌操作下加入约3mL已预先无菌化处理的生理盐水，振荡洗涤沉淀，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，用生理盐水重复洗涤一次，再加入约3 mL无菌生理盐水，振荡混匀，制成接种液，立即使用。
注：为保证接种液中菌群数量，可另外制备1支种子培养液，同法接种、洗涤，加入生理盐水混匀；以生理盐水为对照，用分光光度计在550nm波长下测定混悬液透光率。根据此管透光率调整接种液体积，使透光率在60%~80%范围内。
20分析步骤
注：所有操作避免日光紫外线直射。
20.1试样制备
谷薯类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3 mm~0.5 mm）；肉、蛋、坚果等用匀质器制成食糜；果蔬、半固体食品等用匀浆器混匀；液体试样用前振摇混匀。4℃冰箱可保存1周，-20℃冰箱可保存半年。试样匀质化处理过程中可加入适量水，并称量加水前后试样质量，计算质量换算因子。
20.2试样提取
20.2.1酶解法
谷薯类、肉蛋类、蔬果类、菌藻类、豆及坚果类等食品试样中的泛酸含量应采用酶解法。
水解：准确称取适量试样（m），精确至0.001 g，一般固态及半固态谷薯类、肉类、蛋类、豆类、菌藻类及其制品称取1 g~5 g，新鲜水果、蔬菜等含水量较高的食品称取5 g~10 g，称样量可根据试样泛酸含量进行调整。转入至100 mL锥形瓶中，加10 mL Tris缓冲液、30 mL水，振荡混匀，于121℃高压条件下水解15 min~20 min.
酶解：冷却至室温，依次加入0.1 mL碳酸氢钠溶液、0.4 mL碱性磷酸酶溶液、0.2 mL鸽子肝脏提取液，小心混匀，如果试样中淀粉含量较高，导致样液较为黏稠，可另外加入20mg~40mg a-淀粉酶。加50μL甲苯，具塞，37℃±1℃下以80 r/min±20 r/min振幅振荡水浴8 h~10 h。
定容、沉淀、过滤：将试样酶解液转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度（V），过滤。准确吸取适量滤液（1.0 mL~10.0 mL，V1）至25 mL具塞刻度试管底部，加水至15 mL。如果滤液澄清且滴加冰乙酸没有沉淀出现，用1.0 mol/L乙酸缓冲液直接调节pH至6.8±0.2，用水定容至25 mL（V2）；如果滤液浑浊或滴加冰乙酸有沉淀析出，则用冰乙酸调节pH至4.5±0.1，加水定容至25 mL（V2），过滤后准确吸取适量滤液（5.0 mL~10.0 mL，V3）至另一25 mL具塞刻度试管，用Tris 缓冲液或稀的氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.2，用水定容至25 mL（V4）。
另取一试管按试样提取步骤加入缓冲液、碳酸氢钠溶液、碱性磷酸酶溶液、鸽子肝脏提取液，a-淀粉酶（使用时），振荡水浴后调节pH后定容过滤，作为酶空白液。
20.2.2直接提取法
婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、特殊医学用途配方食品、乳制品、饮料、营养素补充剂、果冻应采用直接提取法。
准确称取适量试样（m），精确至0.001 g，一般固体试样0.2 g~2 g、液态试样1 g~10g或1 mL~10 mL，转入100 mL锥形瓶中，加入10 mL乙酸缓冲液（1.0 mol/L，pH 4.5），30 mL水，于121℃高压条件下水解15 min~20 min，冷却至室温。转入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度（V），混匀后过滤。
注：如果试样液较为浑浊，加入50mgr淀粉酶、100mg木瓜蛋白酶，于40℃±2℃水浴中振荡30min混匀后再定容过滤。
20.3稀释
根据试样液中泛酸含量，用水对试样提取液进行适当稀释（f），试样稀释液中泛酸浓度为2.0ng/mL~ 4.0 ng/mL。
20.4 测定
20.4.1 试管法
20.4.1.1 测定系列管制备
所用试管使用前洗刷干净，用水蒸煮30 min，沥干后放入盐酸溶液中浸泡2 h，取出用水冲洗后经170℃烘干3 h后使用。
取4支试管按表4制备试样或酶空白系列管。四参数曲线拟合。
20.4.1.2接种和培养
向所有测定系列管加入5 mL培养基，盖好塞子（棉塞、塑料胶塞或不锈钢塞），121℃下高压灭菌15 min。
待测定系列管冷却至室温后，在无菌操作条件下向每支测定管加入50 μL接种液。塞好棉塞，充分混匀后，置于36℃±1℃恒温培养箱中孵育20 h~24 h。另准备一支标准0管不接种，作为0对照管。
20.4.1.3测定
将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡混匀器混匀。用厚度1cm比色杯，于550nm处调节标准0管透光率为100%（或吸光度值为0），依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率（或吸光度值）。
注：适宜泛酸测定的光谱范围为540nm~660nm。有以下任一情形终止测定：接种的0对照管有明显的细菌增长；与0对照管相比，标准0管透光率<80%或吸光度值>0.3；与标准0管相比，标准系列管透光率最大变化量<40%或吸光度值变化量<0.4。
20.4.2微孔板法
20.4.2.1无菌处理
先将试样提取液、标准应用液、泛酸测定用培养液及水进行无菌化处理，121℃下高压灭菌15min，或无菌操作下用无菌滤膜（0.22μm）过滤除菌。
20.4.2.2待测系列管制备
取无菌1.1 mL深孔板，按表6、表7配制试样和酶空白系列管、标准系列管，覆膜，振摇混匀。注意消除微孔表面气泡。
20.4.2.3接种和培养
取灭菌泛酸测定用培养液，每10 mL加入40 μL接种液，混匀。
取0.36 mL无菌微孔板，加入150μL标准系列管（2套~3套）、试样和酶空白系列管溶液。每个微孔再加入150 μL已接种的泛酸测定培养液，覆膜，水平摇匀，置于36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h~24 h。
20.4.2.4测定
水平振摇混匀微孔板中培养液，撕膜，消除微孔表面气泡，用酶标仪在550nm处读取吸光度值。
注1：适宜泛酸测定的光谱范围及终止测定的判断标准同试管法。
注2：也可使用与本标准检测原理相同且经等效验证的泛酸检测试剂盒。
21分析结果表述
21.1标准曲线
以标准系列管中泛酸浓度为横坐标，以每个标准点透光率（或吸光度值）均值为纵坐标，绘制标准曲线，拟合四参数曲线方程。
21.2试样结果计算
根据试样和酶空白系列管的透光率（或吸光度值），从标准曲线计算得到对应的泛酸浓度（cx），按照式（3）计算试样稀释液中泛酸浓度（c）。如果试样系列管中有3支以上在标准曲线范围之内，且换算为试样稀释液泛酸浓度的相对偏差≤15%，计为有效管。根据有效管个数按照式（4）计算泛酸稀释液质量浓度平均值（2），并继续按照式（5）或式（6）计算试样中泛酸含量结果。
试样稀释液中泛酸质量浓度及其平均值按式（3）、式（4）计算。
式中：
ci——试样稀释液泛酸质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
cx——由标准曲线计算得到的试样系列管中泛酸质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V5/Vx——-制备试样系列管时最终体积与吸取的试样稀释液体积之比；
`c——试样稀释液泛酸质量浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
——由有效管计算的试样稀释液质量浓度和，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
n——有效管个数。
采用直接提取法的试样按式（5）计算泛酸含量。
式中：
X——试样中泛酸含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；
`c——试样稀释液泛酸质量浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）；
f——试样提取液稀释倍数；
m——试样质量，单位为克（g）；
100——换算系数。
采用酶解法提取的试样，按式（6）计算泛酸含量。
式中：
X——试样中泛酸含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；
`c——试样稀释液中泛酸质量浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
`c0——酶空白液中泛酸质量浓度均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样提取液的定 容体积，单位为毫升（mL）；
V2、V4——调节pH后定容体积，单位为毫升（mL）；
V1、V3——调节pH时吸取的试样提取液体积，单位为毫升（mL）；
f——试样提取液稀释倍数；
m——试样质量， 单位为克（g）；
100/106——换算系数。
结果保留3位有效数字。
22 精密度
一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%；营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
23其他
23.1酶解法提取：称样量为5 g时，检出限为0.025 mg/100 g，定量限为0.05 mg/100 g。
23.2直接提取法：固体称样量为2 g时，检出限为0.025 mg /100 g，定量限0.05 mg/100 g；液体称样量为10 g时，检出限为0.01 mg /100 g，定量限为0.02 mg/100 g。
