中华人民共和国国家标准
GB 1886.355-2022
食品安全国家标准 食品添加剂 甜菊糖苷
前言
本标准代替GB 8270-2014《食品安全国家标准 食品添加剂 甜菊糖苷》。
本标准与GB 8270-2014相比，主要变化如下：
——修改了标准范围；
——修改了分子式、结构式和相对分子质量等相关内容；
——修改了甜菊糖苷含量(以干基计)的指标要求和检验方法；
——修改了“灼烧残渣"指标名称为“灰分"；
——修改了“总砷(以As计)"指标名称为“砷(As)"；
——增加了铅(Pb)、砷(As)的检验方法；
——将鉴别试验中pH的要求放入理化指标。
1范围
本标准适用于以甜叶菊(Stevia Rebaudiana Bertoni)叶为原料，经提取、精制而得的食品添加剂甜菊糖苷。已知糖苷包括甜菊苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷O、杜克苷A、甜茶苷及甜菊双糖苷。
2分子式、结构式和相对分子质量
2.1 13种糖苷的分子式
甜菊苷：C38H60O18
瑞鲍迪苷A：C44H70O23
瑞鲍迪苷B：C38 H60O18
瑞鲍迪苷C：C44H70O22
瑞鲍迪苷D：C50H80O28
瑞鲍迪苷E：C44H70O23
瑞鲍迪苷F：C43H68O22
瑞鲍迪苷M：C56H90O33
瑞鲍迪苷N：C56H90O32
瑞鲍迪苷O：C62H100O37
杜克苷A：C38H60O17
甜茶苷：C32H50O13
甜菊双糖苷：C32H50O13
2.2 13种糖苷的结构式
13种糖苷的化合物名称、R1位取代基和R2位取代基见表1。甜菊醇(R1=R2=H)为甜菊糖苷配基。
2.3 13种糖苷的相对分子质量
甜菊苷：804.87(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷A：967.01(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷B：804.87(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷C：951.01(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷D：1 129.15(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷E：967.01(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷F：936. 99(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷M：1 291.29(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷N：1 275.29(按2018年国际相对原子质量)
瑞鲍迪苷O：1 437.44(按2018年国际相对原子质量)
杜克苷A：788.87(按2018年国际相对原子质量)
甜茶苷：642.73(按2018年国际相对原子质量)
甜菊双糖苷：642.73(按2018年国际相对原子质量)
3技术要求
3.1 感官要求
感官要求应符合表2的规定。
3.2理化指标
理化指标应符合表3的规定。
附录A
检验方法
A.1 一般规定
本标准所用试剂和水在未注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682规定的三级水。试验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品在未注明其他要求时，均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。
A.2 鉴别试验
A.2.1甜菊糖苷色谱试验
在甜菊糖苷含量试验中，试样溶液色谱图中13种糖苷的色谱峰应与混合标准品溶液相对应。
A.3 甜菊糖苷含量(以干基计)的测定
A.3.1试剂和材料
A.3.1.1乙腈：色谱纯。
A.3.1.2磷酸二氢钠：色谱纯。
A.3.1.3 磷酸：色谱纯。
A.3.1.4水：GB/T 6682规定的一级水。
A.3.1.5乙腈水溶液：乙腈和水的体积比为30： 70。
A.3.1.6磷酸钠缓冲液(pH 2.6)：称取1.20 g磷酸二氢钠(NaH2PO4)，溶于800 mL水中，用磷酸调节pH至2.6。
A.3.1.7 瑞鲍迪苷A标准品：瑞鲍迪苷A含量(质量分数，以干基计)≥99.0%。
A.3.1.8瑞鲍迪苷 D标准品：瑞鲍迪苷D含量(质量分数，以干基计)≥95.0%。
A.3.1.9其他11种糖苷标准品：甜菊苷、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷O、杜克苷A、甜茶苷和甜菊双糖苷，或使用13种糖苷混合标准品。
A.3.2仪器和设备
高效液相色谱仪：配备紫外检测器，或其他等效的检测器。
A.3.3 参考色谱条件
A.3.3.1色谱柱：C18反相色谱柱，250 mm×4.6 mm，粒径5 μm；或其他等效的色谱柱。
A.3.3.2流动相梯度洗脱条件(比例可根据实际情况调节)：见表A.1。
A.3.3.3流动相流速：0.8 mL/min。
A.3.3.4 检测波长：210 nm。
A.3.3.5 进样量：2 μL~10 μL。
A.3.3.6柱温：40℃。
A.3.4 分析步骤
A.3.4.1混合标准品溶液的制备
分别称取适量瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷D、甜菊苷瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷O、杜克苷A、甜茶苷和甜菊双糖苷标准品(或13种糖苷混合标准品)，置于同一个容量瓶中，用乙腈水溶液完全溶解后定容，得到混合标准品溶液。混合标准品溶液用于确定13种糖苷的相对保留时间。
A.3.4.2标准溶液的制备
分别称取5.0 mg、10.0 mg、20.0 mg、25.0 mg的瑞鲍迪苷A标准品和2.5 mg、5.0 mg、10.0 mg、12.5mg的瑞鲍迪苷D标准品，精确至0.1mg，分别置于25mL的容量瓶中，用乙腈水溶液溶解后稀释至刻度，分别得到浓度为200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的瑞鲍迪苷A标准溶液和100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、500 mg/L的瑞鲍迪苷D标准溶液。
A.3.4.3试样溶液的制备
称取25.0 mg±5.0 mg试样(干基)，精确至0.1 mg，置于50 mL的容量瓶中，用乙腈水溶液溶解后稀释至刻度，得到试样溶液。
A.3.5 测定
A.3.5.1标准曲线的绘制
在A.3.3参考色谱条件下，分别对200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的瑞鲍迪苷A标准溶液和100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、500 mg/L的瑞鲍迪苷D标准溶液进行色谱分析，记录各浓度标准溶液对应的峰面积值。以标准溶液色谱图中瑞鲍迪苷A或瑞鲍迪苷D的峰面积值为Y轴，以对应溶液浓度(mg/L)为X轴，绘制标准曲线，分别得到瑞鲍迪苷A标准曲线和瑞鲍迪苷D标准曲线(强制过原点)，从标准曲线上分别获得瑞鲍迪苷A线性函数斜率(Ka)和瑞鲍迪苷D线性函数斜率(Kd)。
A.3.5.2含量测定
在A.3.3参考色谱条件下，分别对混合标准品溶液和试样溶液进行色谱分析。将试样溶液的色谱图与混合标准品溶液的色谱图(见附录B)相比较，以确定试样溶液色谱图中各组分对应的峰。记录试样溶液色谱图中瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷D、甜菊苷、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷O、杜克苷A、甜茶苷和甜菊双糖苷的峰面积。
A.3.6 结果计算
8种糖苷含量(以干基计)的质量分数w；按式(A.1)计算。
式中：
i——s、a、b、c、f、da、ru、sb，分别对应甜菊苷瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊双糖苷；
fi——i组分与瑞鲍迪苷A的式量比值：1.00(瑞鲍迪苷A)、0.83(甜菊苷)、0.83(瑞鲍迪苷B)、
0.98(瑞鲍迪苷C)、0.97(瑞鲍迪苷F)、0.82(杜克苷A)、0.66(甜茶苷)、0.66(甜菊双糖苷)；
Ai——试样溶液色谱图中i组分的峰面积值；
Ka—— A.3.5.1 中瑞鲍迪苷A线性函数斜率；
c——试样溶液的浓度，单位为毫克每升(mg/L)。
5种糖苷含量(以干基计)的质量分数ωi按式(A.2)计算。
式中：
i——d、e、m、n、o，分别对应瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷O；
fi——i组分与瑞鲍迪苷D的式量比值：1.00(瑞鲍迪苷D)、0.86(瑞鲍迪苷E)、1.14(瑞鲍迪苷
M)、1.13(瑞鲍迪苷N)、1.27(瑞鲍迪苷O)；
Ai——试样溶液色谱图中i组分的峰面积值；
Kd——A.3.5.1 中瑞鲍迪苷D线性函数斜率；
c——试样溶液的浓度，单位为毫克每升(mg/L)。
由式(A.1)和式(A.2)计算得到13种组分的含量ωs、ωa、ωb、ωc、ωf、ωda、ωru、ωsb、ωd、ωe、ωm、ωn和ω0，取各组分含量之和即为试样中甜菊糖苷含量。
A.4 pH的测定
A.4.1仪器和设备
酸度计。
A.4.2试剂和材料
称取1 g试样，溶于100 mL除去二氧化碳的水中，用酸度计测定试样溶液的pH。
A.5 甲醇和乙醇的测定
A.5.1试剂和材料
A.5.1.1 甲醇：色谱纯。
A.5.1.2乙醇：色谱纯。
A.5.1.3水：GB/T 6682规定的一级水。
A.5.2仪器和设备
气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器(FID)和顶空进样器。
A.5.3参考色谱条件
A.5.3.1色谱柱：键合聚乙二醇熔融石英毛细管柱(柱长为30 m，柱内径为0.25 mm，膜厚度为0.25 μm)，或其他等效的色谱柱。
A.5.3.2载气：氮气( 纯度≥99.99%)。
A.5.3.3载气流量：5.0 mL/ min。
A.5.3.4 柱温：40℃保持5 min，以10℃/min升温至120℃，保持2 min，最后以16℃/min升温至
200℃，保持5 min。
A.5.3.5进样口温度：200℃。
A.5.3.6检测器温度：250℃。
A.5.3.7进样体积：1 mL。
A.5.3.8分流比：1 ： 50。
A.5.4参考顶空条件
A.5.4.1顶空瓶温度：80℃。
A.5.4.2顶空瓶平衡时间：30 min。
A.5.5分析步骤
A.5.5.1空白溶液的制备
移取2 mL水，置于顶空瓶中，迅速压紧瓶盖，备用。
A.5.5.2标准溶液的制备
A.5.5.2.1甲 醇标准溶液的制备
称取0.1 g甲醇，精确至0.001 g，用水稀释后转移至一个1 000 mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得100 mg/L的甲醇标准储备溶液。将该溶液配制成一系列浓度为2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L的甲醇标准溶液。移取上述系列浓度溶液各2 mL，分别置于顶空瓶中，迅速压紧瓶盖，备用。
A.5.5.2.2乙醇标准 溶液的制备
称取0.1 g乙醇，精确至0.001 g，用水稀释后转移至一个100 mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得1 000 mg/L的乙醇标准储备溶液。将该溶液配制成一系列浓度为50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L和750 mg/L的乙醇标准溶液。移取上述系列浓度溶液各2 mL，分别置于顶空瓶中，迅速压紧瓶盖，备用。
A.5.5.3试样溶液的制备
称取1.0g试样，精确至0.001 g，用水溶解后转移至-个10 mL的容量瓶中，在室温下超声处理约3 min，加水稀释至刻度，摇匀。移取该溶液2 mL置于顶空瓶中，迅速压紧瓶盖，备用。
A.5.6 测定
在参考操作条件A.5.3和A.5.4下，分别对空白溶液、标准系列溶液和试样溶液进行测定，记录甲醇或乙醇的峰面积值。以标准系列溶液色谱图中甲醇或乙醇的峰面积值为Y轴，以对应溶剂浓度(mg/L)为X轴，绘制标准曲线，得到甲醇标准曲线或乙醇标准曲线。根据试样溶液色谱图中甲醇或乙醇的峰面积值，从标准曲线求得试样溶液中甲醇或乙醇的浓度(mg/L)。
A.5.7结果计算
试样中甲醇或乙醇的含量w，单位为毫克每千克(mg/kg) ，按式(A.3)计算。
式中：
c——从标准曲线求得的试样溶液中甲醇或乙醇的浓度，单位为毫克每升(mg/L)；
V——试样溶液的体积，单位为毫升(mL)；
m——试样的质量，单位为克(g)。
