中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4307-2023
葛根中黄酮类化合物的测定
高效液相色谱-串联质谱法
Determination of flavonoids in the root of kudzu vine-
High performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)
前言
本文件按照GB/T 1. 1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出。
本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口。
本文件起草单位：北京工业大学、浙江省农业科学院、广西壮族自治区农业科学院。
本文件主要起草人：张芳、齐沛沛、王颖、王雨婷、智美丽、裴鹭羽、李宜珊、严华兵、尚小红。
1范围
本文件规定了葛根中黄酮类化合物的高效液相色谱-串联质谱的定量检测方法。
本文件适用于野葛和粉葛中葛根素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素和鹰嘴豆芽素A等11种黄酮类化合物含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的务款。其中。注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试险方法。
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
葛根样品中的黄酮类化合物用乙醇水溶液超声提取，采用高效液相色谱串联质谱仪测定，外标法定量。
5试剂和材料
除非另有规定，所有试剂均为分析纯。
5.1试剂
5.1.1水：GB/T 6682，一级。
5.1.2甲醇(CH40)：色谱纯。
5.1.3甲酸(CH2O2)：色谱纯。
5.1.4 乙醇(C2H6O)：分析纯
5.2试剂配制
5.2.1 10%甲醇溶液：取10 mL，甲醇（5.1.2），加水(5.1.1)定容至100 mL，混匀。
5.2.2 30%乙醇溶液：取30 ml，乙醇(5.1. 4).加水(5.1.1)定容至100 mL，混匀。
5.3标准
黄酮类化合物标准品：相关信息见表1，纯度不低于98%。
5.4标准溶液配制
5.4.1黄酮类化合物标准储备液：准确称取11种(表1)待测物质的标准品，用甲醇(5.1.2)溶解后，加入10%甲醇溶液(5.2.1)定量稀释，制成高浓度单标准品储备液。分别移取一定量的11种单标准品储备液于25 mL容量瓶，10%甲醇溶液(5.2.1)定容，制成10 mg/L的母液作为标准品储备液。避光-18℃以下保存，备用。
5.4.2黄酮类化合物混合标准溶液：用10%甲醇溶液(5.2.1)对10 mg/L的母液(5.4. 1)稀释配成不同浓度的混合标准溶液用于绘制标准曲线。混合标准溶液应现用现配。
6仪器设备
6.1超高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源( ESI)。
6.2电热鼓风干燥箱：温度50℃~330℃，功率3.1 kW。
6.3超声波清洗器：超声输入功率200 W。
6.4离心机：转速不低于7 500 r/min。
6.5超细水冷式粉碎机：细度20目~180目(0.85mm~0.09mm)，功率2.5kW。
6.6天平：感量0.001 g和0.000 1 go
7试样制备
7.1试样制备
新鲜葛根经清洗去掉泥沙、去皮，用切片机切成2 mm薄片后，放置于托盘中，于70℃烘箱中烘干至恒重。然后用分级超细水冷式粉碎机将葛根样品粉碎，全部装入洁净的容器中，立即检测。如果需要较长时间保存，将样品密封、标记后于-18℃以下保存。
7.2 试样提取
称取葛根粉末0.5 g(精确至0.000 1 g)，置于50 mL离心管中，加入25 ml 30%乙醇溶液(5.2.2)，
室温下超声提取45 min。于7 500 r/min离心5 min，将上清液转移至50 mL容量瓶中。沉淀物再用30%乙醇溶液(5.2. 2)洗涤2次，每次用量约5 mL。在相同条件下离心5 min，合并上清液， 30%乙醇溶液(5.2.2)定容至50 mL。上样前，采用0.22μm有机相滤膜过滤(5.5)。
8测定
8.1超高效液相色谱参考条件
8.1.1色谱柱：ACE Excel C18柱(100mm×2.1mm×1.7μm)或性能相当者。
8.1.2流动相 A：甲醇(5.1.2)。
8.1.3流动相 B：0. 1%甲酸水溶液，取0.1 mL甲酸(5.1. 3)加水(5.1.1)定容至100 mL，混匀。
8.1.4柱温：40℃。
8. 1.5 流速：0.3 mL/min。
8.1.6进样量 ：10μL。
8.1.7流动相：梯度洗脱程序见表2。
8.2质谱参考条件
8.2.1扫描方式：正负离子扫描。
8.2.2离子化电压：4 000 V。
8.2.3毛细管温度：250℃。
8.2.4碰撞气体：氩气(纯度为99. 99%)，压力为270 kPa。
8.2.5雾化气：氮气(纯度为97%以上)，流速为3. 0 L/min。
8.2.6辅助气：氮气(纯度为97%以上) ，流速为10.0 L/min。
8.2.7检测方式： 多反应监测(MRM)。
8.2.8黄酮类化合物保留时间和监测离子对信息见附录A.
3.3 供试样品的测定
在仪器的最佳条件下，分别取黄酮类化合物混合标准溶液(5.4.2)与葛根素等11种黄酮类化合物样品(7.2)上机测定。混合标准溶液中11种黄酮类化合物总离子色谱图和各组分离子色谱图见附录A。
8.4定性测量
在相同试验条件下测定试样和混合标准溶液，若样品溶液中检出色谱峰的保留时间与基质标准溶液中目标物色谱峰的保留时间一致(变化范围在±2.5%)，且样品溶液的质谱离子对相对丰度与依度相当基质标准溶液的质谱离子对相对丰度相比较，相对离子丰度的相对偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在该组分。混合标准溶液中各黄酮类化合物离子色谱图见附录B。
8.5定量测量
以不同浓度混合标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积(响应值)为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。如超出线性范围，应重新试验或将试样溶液和基质匹配混合标准系列溶液作相应稀释后重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与溶剂混合标准溶液的浓度相差不超过30%。标准加入法则以添加的标准溶液浓度为横坐标、色谱峰面积(响应值)为纵坐标，绘制标准曲线，并外推至浓度坐标轴。
8.6结果计算
用液相色谱质谱数据处理软件或者按照公式计算试样中检测目标物量，按公式(1)计算。
式中：
ω——试样中黄酮类化合物的含量的数值，单位为毫克每千克(mg/kg)；
A——样品中黄酮类化合物的峰面积；
ρS——标准溶液浓度 的数值，单位为毫克每升(mg/L)；
V——定容体积的数值， 单位为毫升(mL)；
f——稀释倍数；
AS——标样中黄酮类化合物的峰面积；
m——最终溶液所代表的试样质量的数值，单位为克(g)。
注：计算结果应扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
9精密度
9.1 重复性
在重复性条件下获得的2次独立的测定结果的绝对差值不大于这2个测定值的算术平均值的15%。
9.2 再现性
在再现性条件下获得的2次独立的测定结果的绝对差值大于2个测定值的算术平均值的15%。
10检出限和定量限
葛根样品中大豆苷、葛根素、3'-甲氧基葛根素和刺芒柄花黄素的检出限为0.01 mg/kg， 定量限为0.03 mg/kg；刺芒柄花苷、3'-甲氧基葛根素和异甘草素的检出最为0.02mg/kg，定量限为0.07 mg/kg；大豆苷元、染料木素、染料木苷和鹰嘴豆芽素A的检出限为0.03mg/kg，定量限为0.1 mg/kg。
