中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5512-2023
出口动物源食品中那西肽残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法
Determination of nosiheptide residue in foodstuffs of animal origin for export-LC-MS/MS method
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳职业技术学院、中华人民共和国杭州海关。
本文件主要起草人：赵凤娟、沈金灿、郭伟杰、康海宁、岳振峰、朱萍萍、蒋沁婷、林伟坚、华红慧。
1 范围
本文件规定了动物源食品中那西肽残留量的液相色谱-质谱/质谱检测和确证方法。
本文件适用于猪肉、猪肝、牛肉、牛肝、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、鱼、虾、牛奶等动物源食品中那西肽残留量的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 方法提要
试样用乙腈提取，正己烷脱脂，HLB固相萃取柱净化，氮吹浓缩，酸化乙腈定容。采用高效液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量。
5 试剂与材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定中的一级水。
5.1 试剂
5.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.2 甲酸（HCOOH）。
5.1.3 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5.1.4 二甲基亚砜（CH3）2SO。
5.1.5 乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。
5.1.6 正己烷（CH3（CH2）4CH3）。
5.1.7 无水硫酸钠（Na2SO4）：500℃烘4 h，置于干燥器中备用。
5.2 试剂配制
5.2.1 1%甲酸乙腈溶液：准确吸取5.00 mL甲酸（5.1.2）于500 mL 容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀释到刻度，混合混匀。
5.2.2 2%甲酸乙腈溶液：准确吸取1.00 mL甲酸（5.1.2）于50 mL 容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀释到刻度，混合混匀。
5.2.3 乙腈饱和正己烷：量取200 mL正己烷（5.1.6）于250 mL分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振摇数分钟，待分配平衡后，弃去下层乙腈层即得。
5.2.4 乙腈-水（4+1，体积比）：量取80 mL乙腈和20 mL水，混匀。
5.3 标准品
那西肽标准物质：C51H43N13O12S6，CAS号56377-79-8，纯度77.6%；或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.4 标准溶液配制
5.4.1 标准储备溶液（200 μg/mL）：准确称取经折算相当于10 mg（精确到0.1 mg）的那西肽，用250 μL二甲基亚砜（5.1.4）溶解，乙腈定容至50 mL，配成标准储备溶液。-20℃下避光保存，有效期为2个月。
5.4.2 标准中间溶液（5 μg/mL）：准确吸取1.25 mL 那西肽标准溶液（5.4.1）用乙腈定容至50 mL。该溶液于-20℃保存，有效期为1个月。
5.4.3 标准使用液（200 ng/mL）：准确吸取0.400 mL那西肽标准中间溶液（5.4.2）用1%甲酸乙腈溶液（5.2.1）定容至10 mL，现用现配。
5.4.4 基质标准工作溶液：根据那西肽的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的标准使用液（5.4.3），用空白样品提取液配成系列浓度的基质标准工作溶液，配制浓度为1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL，现用现配。
5.5 材料
固相萃取柱：亲脂性二乙烯苯-亲水性N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（Oasis HLB 固相萃取）小柱，3 mL/60 mg，或相当者。使用前先用3 mL甲醇活化，再用3 mL乙腈-水（5.2.4）平衡柱子，保持柱体湿润。
6 仪器和设备
6.1 液相色谱-质谱/质谱仪。
6.2 涡旋混合器。
6.3 离心机：转速不低于9 500 r/min。
6.4 高速组织捣碎机。
6.5 氮气浓缩装置。
6.6 分析天平：感量为0.1 mg和0.01 g。
6.7 移液枪：100 μL、1 mL、5 mL。
6.8 固相萃取装备。
6.9 超纯水仪。
6.10 玻璃管：15 mL，带刻度。
6.11 聚丙烯离心管：15 mL、50 mL，具塞。
6.12 微孔滤膜：聚四氟乙烯亲水型，0.22μm。
7 试样制备与保存
7.1 动物组织、内脏猪肉、猪肝、牛肉、牛肝、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、鱼、虾等原始样品，经高速组织捣碎机均匀捣碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，分别装入干净容器内，加封后做出标记，一份作为试样，一份作为留样。将试样于-20℃下保存。
7.2 牛奶
从原始样品中取出代表性样品，用组织捣碎机充分混匀，均分成两份，分别装入干净容器中，加封后做出标记，一份作为试样，一份作为留样。将试样于4℃避光保存。
8 测定步骤
8.1 提取
8.1.1 肌肉、内脏、鱼、虾和牛奶
准确称取2 g（精确到0.01 g）样品，于50 mL 具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入8 mL乙腈，涡旋振荡10 min，9 500 r/min离心5 min，取上清液于另一50 mL离心管中，加入8 mL乙腈重复提取一次，合并提取液，加入水定容至20 mL，涡旋混合1 min。准确吸取10 mL混合提取液，加入3 mL乙腈饱和正己烷（5.2.3），上下轻摇20次，9 500 r/min离心5 min，收集乙腈层，备用。
8.1.2 鸡蛋
准确称取2 g（精确到0.01 g）样品，于50 mL 具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入8 mL 1%甲酸乙腈提取液（5.2.1），涡旋振荡10 min，于9 500 r/min离心5 min，取上清液于另一50 mL 离心管中，加入8 mL 1%甲酸乙腈提取液（5.2.1）重复提取一次，合并提取液，加水定容至20 mL，涡旋混合1 min。准确吸取10 mL混合提取液于15 mL 具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入3 mL乙腈饱和正己烷（5.2.3），上下轻摇20次，9 500 r/min离心5 min，收集乙腈层，备用。
8.2 净化
取备用液，以1滴/s的速度过HLB固相萃取柱（5.5），待样液完全流出后，抽干，收集全部流出液。流出液中加入1 g无水硫酸钠，涡旋混合1 min，9 500 r/min离心5 min，静置分层，取上清液于15 mL刻度玻璃管中。将上清液50℃下吹氮浓缩至0.5 mL 左右，加入2%甲酸乙腈溶液（5.2.2）定容至1 mL，混匀，过0.22 μm 微孔滤膜，供高效液相色谱-质谱/质谱测定。用阴性样品按照8.1和8.2操作步骤，制备用于配置系列基质标准工作溶液的样品空白提取液。
8.3 测定
8.3.1 液相色谱条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C18，100 mm×2.1 mm（内径），粒度2.6μm，或相当者；
b）柱温：30℃；
c）进样量：20μL；
d）流速：0.2 mL/min；
e）流动相及洗脱条件见表1。
8.3.2 质谱条件
质谱参考条件如下：
a）电离方式：电喷雾电离（ESI）；
b）雾化器流量（N）：3 L/min；
c）加热气流量（F）：10 L/min；
d）接口温度（I）：300℃；
e）脱溶剂温度：526℃；
f）DL温度（D）：250℃；
g）加热块温度（H）：400℃；
h）干燥气流量（G）：10 L/min；
i）扫描方式：负离子模式；
j）监测方式；多重反应监测（MRM），监测条件参见表2。
8.3.3 液相色谱-质谱/质谱测定
8.3.3.1 标准曲线的制作
在仪器最佳工作条件下，将标准系列工作液按浓度由低到高的顺序（不少于5个点），依次进样。以那西肽的峰面积为纵坐标，以系列标准溶液中那西肽浓度（μg/L）为横坐标，绘制标准曲线。那西肽标准工作溶液的液相色谱-质谱/质谱多反应监测（MRM）色谱图参见图 A.1。
8.3.3.2 定性测定
按照上述液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果待测物质色谱峰的保留时间与标准溶液相比在±2.5%的允许偏差内；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，且每个离子对的信噪比均≥3，可判断样品中存在相应的被测物。
8.3.3.3 定量测定
将样品溶液（8.2）注入液相色谱-质谱/质谱仪中，按照仪器参考条件（8.3）进行测定，样品溶液中待测物的响应值应在标准曲线的线性范围内。如果超出线性响应范围，应用空白基质溶液进行适当稀释。
8.4 空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤操作。
9 结果计算和表述
按公式（1）计算那西肽含量。
式中：
Xi——试样中那西肽化合物的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——由标准曲线得到的测定液中待测化合物的浓度，单位为微克每升（μg /L）；
V——试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）；
1 000——换算系数；
计算结果需扣除空白值，保留三位有效数字。
10 方法定量限
那西肽的检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg
11 准确度和精密度
本方法对猪肉、猪肝、牛肉、牛肝、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、鱼、虾、牛奶等基质进行添加回收率试验，不同基质中不同添加水平下的平均回收率和相对标准偏差数据见表4。
