中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1988-2023
代替 SN/T 1988-2007
出口动物源食品中头孢类抗生素残留量的测定
液相色谱-质谱/质谱法
Determination of cephalisporins residues in foodstuffs of animal origin for export-LC-MS/MS Method
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替SN/T 1988-2007《进出口动物源食品中头孢氨苄、头孢匹林和头孢唑啉残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》，与SN/T 1988-2007相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下：
——更改了文件名称为“出口动物源食品中头孢类抗生素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法"；
——更改了“范围"，增加了肠衣和脂肪，检测药物增加了头孢哌酮、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢呋辛、头孢乙腈和去乙酰基头孢匹林（见第1章；2007版的第1章）；
——更改了“测定步骤"的内容（见第8章；2007版的第7章）；
——更改了“检出限和定量限"的内容（见第10章；2007版的第9章）。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、大连海关技术中心、中国肉类食品综合研究中心、北京中认检测技术服务有限公司。
本文件主要起草人：崔凤云、齐鹤鸣、韩深、张朝晖、张雷、苏明明、李妍、梁娜娜、古瑾、刘扬。
本文件于2007年首次发布，本次为第一次修订。
1 范围
本文件规定了动物源食品中头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢呋辛、头孢乙腈、头孢匹林和头孢匹林代谢物去乙酰基头孢匹林的液相色谱-质谱/质谱测定方法。
本文件适用于动物肌肉、肝脏、肾脏、肠衣、脂肪、鸡蛋和牛奶中头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢呋辛、头孢乙腈、头孢匹林和头孢匹林代谢物去乙酰基头孢匹林的液相色谱-质谱/质谱测定和确证。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 原理
试样中残留的头孢类药物，经乙腈-水溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。
5 试剂和材料
除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1 乙腈：色谱纯。
5.2 甲醇：色谱纯。
5.3 甲酸：色谱纯。
5.4 乙酸铵：色谱纯。
5.5 磷酸二氢钾。
5.6 氢氧化钠。
5.7 氯化钠。
5.8 乙腈-水溶液（15：2，体积比）：量取150 mL乙腈和20 mL水，混匀。
5.9 乙腈-水溶液（3：7，体积比）：量取30 mL乙腈和70 mL水，混匀。
5.10 甲醇-水溶液（1：9，体积比）：量取10 mL甲醇和90 mL水，混匀。
5.11 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取4 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1 000 mL。
5.12 饱和氯化钠溶液：称取40 g氯化钠，加入100 mL水，搅拌，混匀。
5.13 0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=8.5）：称取8.7 g磷酸二氢钾，加水溶解并稀释至1 000 mL，用0.1 moL/L氢氧化钠溶液调节pH 值至8.5±0.1。
5.14 5 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.01%甲酸）：称取0.385 g乙酸铵于1 L水中，加入0.1 mL甲酸，混匀。
5.15 头孢类药物标准物质：头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢呋辛、头孢乙腈、头孢匹林和去乙酰基头孢匹林9种头孢类化合物的中英文名、CAS号、分子式和分子量见附录A 中表A.1，纯度均大于95%。
5.16 头孢类药物标准储备液：分别称取头孢类药物标准物质（5.15）各10 mg（精确至0.1 mg），分别用乙腈-水溶液（5.9）溶解并稀释定容至25 mL容量瓶中，配制成浓度为400 μg/mL的标准储备液。于-18℃避光保存，有效期3个月。
5.17 头孢类药物混合标准中间液：分别准确移取各头孢类药物标准储备液（5.16）0.25 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈-水溶液（5.9）稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL的混合标准中间液。于-18℃避光保存，有效期1个月。
5.18 头孢类药物基质混合标准工作液：准确移取头孢类药物混合标准中间液（5.17）适量，用空白基质溶液逐级稀释成浓度为5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/m、100.0 ng/mL、200.0 ng/mL的基质混合标准工作液，现用现配。
5.19 固相萃取小柱：HLB（填料为：N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物），500 mg/6mL，或相当者；使用前依次用5 mL甲醇、5 mL磷酸盐缓冲溶液（5.13）活化。
5.20 微孔滤膜：0.2 μm，聚丙烯、聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯材质。
6 仪器和设备
6.1 液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。
6.2 分析天平：感量分别为0.000 1 g和0.01 g。
6.3 离心机：10 000 r/min。
6.4 肉类组织粉碎机。
6.5 减压旋转蒸发仪。
6.6 氮吹浓缩仪。
6.7 涡旋混匀器。
6.8 均质器：≥10 000 r/min
7 试样制备与保存
7.1 试样的制备
7.1.1 动物肌肉、肝脏、肾脏、脂肪
取代表性样品约500 g，用组织粉碎机粉碎，装入洁净容器作为试样，密封并标明标记。
7.1.2 肠衣
取代表性样品约300 g，用剪刀剪碎，装入洁净容器作为试样，密封并标明标记。
7.1.3 鸡蛋
取代表性样品约500 g，去壳，将蛋液搅匀，装入洁净容器，密封并标明标记。
7.1.4 牛奶
将牛奶从冰箱中取出，放置至室温、摇匀，备用。
7.2 试样的保存
动物肌肉、肝脏、肾脏、肠衣、脂肪、鸡蛋试样于-20 ℃以下条件下保存；牛奶试样置于0℃~4℃条件下保存。在抽样及制样的操作过程中，应防止试样受到污染或发生残留物含量的变化。
8 测定步骤
8.1 提取
8.1.1 动物肌肉、肝脏、肾脏、肠衣、脂肪、鸡蛋
称取试样2 g（精确至0.01 g）至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈-水溶液（5.8），均质提取1 min，10 000 r/min离心5 min，上清液转移至鸡心瓶中，残渣中加入10 mL乙腈-水溶液（5.8），涡旋振荡使残渣分散后，重复均质提取1 min，10 000 r/min离心5 min，上清液合并至鸡心瓶中。鸡心瓶置于旋转蒸发器上（40℃水浴）蒸发至除去乙腈（易起沫试样可加入4 mL饱和氯化钠溶液），立即加入20 mL磷酸盐缓冲溶液（5.13），涡旋混匀后待净化。
8.1.2 牛奶
称取试样2 g（精确至0.01 g）至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，均质提取1 min，10 000 r/min离心5 min，上清液转移至鸡心瓶中，残渣中加入10 mL乙腈，涡旋振荡使残渣分散后，重复均质提取1min，10 000 r/min离心5 min，上清液合并至鸡心瓶中。鸡心瓶置于旋转蒸发器上（40 ℃水浴）蒸发至除去乙腈（易起沫试样可加入4 mL饱和氯化钠溶液）。立即加入20 mL磷酸盐缓冲溶液（5.13），涡旋混匀后待净化。
8.2 净化
待净化液移至已活化的固相萃取柱（5.19）中，流速维持在1 mL/min，依次用3 mL磷酸盐缓冲溶液（5.13），2mL水淋洗，5mL甲醇洗脱于离心管中。将洗脱液于40 ℃氮气吹干，用甲醇-水溶液（5.10）定容至1 mL，涡旋混匀，经0.2 μm 滤膜过滤后，供液相色谱-质谱/质谱测定。
8.3 测定
8.3.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下。
a）色谱柱：C18 柱，100 mm×2.1 mm，1.9 μm 或相当者。
b）流动相：A 为5 mmol/L 乙酸铵水溶液（含0.01%甲酸），B 为甲醇，梯度洗脱，洗脱程序见表1。
c）流速：0.25 mL/min。
d）柱温：30℃。
e）进样量：10 μL。
8.3.2 质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子；
c）检测方式：多反应监测（MRM）；
d）其他参考质谱条件见附录B。
8.3.3 液相色谱-质谱/质谱测定
8.3.3.1 定性测定
按照液相色谱-质谱/质谱条件测定试样和基质混合标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准物质保留时间相差不超过±2.5%，定性离子对的相对丰度（是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示）与浓度相当基质标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断试样中存在对应的被测物。
8.3.3.2 定量测定
根据试样中头孢类药物的含量情况，选取响应值相近的基质标准工作液一起进行色谱分析。基质标准工作液和待测液中头孢类药物的响应值应在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件下头孢类药物的多反应监测（MRM）色谱图见附录C。
8.4 空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤进行。
9 结果计算与表述
采用基质匹配标准曲线定量，试样中9种头孢类药物的含量由液相色谱-质谱/质谱仪的数据处理软件或按公式（1）计算，计算结果需扣除空白值。
式中：
X——试样中待测组分含量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——由基质匹配标准曲线得到的样液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样溶液所代表最终试样的质量，单位为克（g）。
计算结果保留3位有效数字。
10 检出限、定量限和回收率
10.1 检出限和定量限
猪肉、鸡肉、猪肝、猪肾、肠衣、脂肪、鸡蛋、牛奶中头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢呋辛、头孢乙腈、头孢匹林、去乙酰基头孢匹林的检出限为2.0 μg/kg，定量限为5.0 μg/kg。
10.2 回收率
猪肉、鸡肉、猪肝、猪肾、肠衣、脂肪、鸡蛋、牛奶中9种头孢类药物的添加水平和回收率数据见附录D。
