中华人民共和国国家标准
GB/T 39999-2021
化妆品中恩诺沙星等15种禁用喹诺酮类抗生素的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of 15 kinds of prohibited quinolone-type antibiotics in cosmetics including enrofloxacin-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
本标准由中国轻工业联合会提出。
本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会（SAC/TC 257）归口。
本标准起草单位：江苏省产品质量监督检验研究院、嘉文丽（福建）化妆品有限公司、无限极（中国）有限公司、苏州绿叶日用品有限公司、江苏奇力康皮肤药业有限公司、苏州世谱检测技术有限公司、广州质量监督检测研究院、上海市日用化学工业研究所、上海相宜本草化妆品股份有限公司、欧诗漫生物股份有限公司、广州市娇兰化妆品有限公司、完美（广东）日用品有限公司、江苏省食品药品监督检验研究院、常州市食品药品监督检验中心、河北省食品检验研究院、常州检验检测标准认证研究院。
本标准主要起草人：卢剑、曲梅、曹倩文、饶焕文、杨琼利、刘冬、吕智、寻知庆、沈敏、吴克、张征、张晓强、邹洁、杨洋、张丽华、顾洁、孙红梅、候爱霞、杨梅、张岩、林建平、宋淑文、周奇、李淑琴、杨安全、张彦红、范素芳、黄金凤、孙姗姗、马明、陈汉金、陈晓珍、郭新东、吴玉銮、彭露、王常捷、武中平。
引言
本标准的被测物质是我国《化妆品安全技术规范（2015年版）》规定的禁用物质。
禁用物质是指不能作为化妆品生产原料即组分添加到化妆品中的物质。《化妆品安全技术规范（2015年版）》规定：若技术上无法避免禁用物质作为杂质带入化妆品时.国家有限量规定的应符合其规定；未规定限量的，应进行安全性风险评估，确保在正常、合理及可预见的使用条件下不得对人体健康产生危害。
目前我国尚未规定这些物质的限量值，本标准的制定，仅对化妆品中测定这些物质提供检测方法。
1范围
本标准规定了化妆品中15种禁用喹诺酮类抗生素的液相色谱-串联质谱测定方法的原理、试剂或材料、仪器设备、试验步骤、结果计年、回收率和精密度、允许差等内容。
本标准适用于水剂类、乳液类和非蜡基膏霜类化妆品中依诺沙星、麻保沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、奥比沙星、沙拉沙星、司帕沙星、双氟沙星和莫西沙星的测定。
本标准不适用于粉类化妆品中喹诺酮类抗生素的测定。
本标准15种喹诺酮类抗生素的方法检出限均为0.15 mg/kg，定量限均为0.50 mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试样中的15种喹诺酮类抗生素采用酸化乙腈提取，离心后合并提取液并浓缩，正己烷净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。
4试剂或材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。
4.1水，GB/T 6682一级。
4.2乙腈：色谱纯。
4.3甲酸：色谱纯。
4.4正己烷：色谱纯。
4.5 0.1%甲酸乙腈溶液：准确量取1.0 mL甲酸（4.3）至1 000 mL容量瓶中，用乙腈（4.2）稀释至刻度。
4.6 0.1%甲酸溶液：准确量取1.0mL甲酸（4.3）至1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度。
4.7定容液：准确量取10 mL乙腈（4.2）和90 mL 0.1%甲酸溶液（4.6），混匀。
4.8乙腈饱和的正己烷溶液：量取20 mL乙腈（4.2），加入到50 mL正己烷（4.4）中，混匀，静置，上层清液备用。
4.9标准物质：纯度均不小于98% ，15种喹诺酮类抗生素标准物质的中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量及化学结构式参见附录A中表A.1。
4.10混合标准工作溶液：分别准确称取适量标准物质（4.9）（精确至0.1mg），用乙腈（4.2）配制成质量浓度为1 000μg/mL的单标标准贮备液（于4℃避光保存，可保存3个月）。准确移取各单标标准贮备液0.25mL于50mL容量瓶中，用乙腈（4.2）定容，制得混合标准中间工作溶液（各为5μg/mL，现配现用）。取相应的空白样品，按照6.1进行处理，得到基质溶液。准确移取适量混合标准中间工作溶液，用基质溶液逐级稀释成质量浓度为5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L的系列混合标准工作溶液（现配现用）。
4.11滤膜：孔径为 0.22μm的聚四氟乙烯滤膜。
5仪器设备
5.1 液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：配有电喷雾离子源。
5.2 分析天平：感量0.001 g和0.000 1 g。
5.3涡旋振荡器。
5.4超声波清洗仪：工作频率不低于40 kHz。
5.5离心机：最高转速不低于4 000 r/ min。
5.6 氮吹仪。
6试验步骤
6.1试样处理
称取试样1.0 g（精确至0.00 1 g），置于15 mL具塞塑料离心管中，加入8 mL 0.1%甲酸乙腈溶液（4.5），涡旋振荡1 min，超声提取20 min，4 000 r/min离心2 min，取上清液。残渣用8 mL 0.1%甲酸乙腈溶液（4.5）重复提取一次，合并上清液，用0.1%甲酸乙腈溶液（4.5）定容至25 mL。准确移取1.0 mL上述提取液，于50℃水浴中氮吹至近干，用定容液（4.7）定容至2.0 mL，加入2 mL乙腈饱和的正己烷溶液（4.8），涡旋振荡1 min，4 000 r/min离心2 min，下层清液经滤膜过滤后供液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定。
6.2 测定
6.2.1液相色谱参考工作条件
液相色谱参考工作条件如下：
a）色谱柱：C18柱，1.9μm，100 mm×2.1 mm（内径）或C18柱.5.0μm，150 mm×4.6 mm（内径）；
b）流动相：A：0.1%甲酸乙腈溶液（4.5）和B：0.1%甲酸溶液（4.6），进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；
c）流速：0.3 mL/min；
d）柱温：30℃；
e）进样量：5μL。
6.2.2 质谱参考工作条件
质谱参考工作条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源（ESI）；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）喷雾电压：5 500 V；
d）离子源温度：400℃；
e）雾化气压力：0.345 MPa；
f）辅助气压力：0.414 MPa；
g）气帘气压力：0.138 MPa；
h）检测方式：多 反应监测（MRM）；
i）15种喹诺酮类抗生素母离子、子离子、保留时间及其他质谱参数见表2。
6.2.3标准工作曲线绘制
将混合标准工作溶液（4.10），按高效液相色谱和质谱参考工作条件（6.2.1和6.2.2）进行测定，以定量离子色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的溶液浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。15种喹诺酮类抗生素标准物质的多反应监测色谱图参见附录B中图B.1。
6.2.4试样测定
按高效液相色谱和质谱参考工作条件（6.2.1和6.2.2）测定试样溶液（6.1）。如果试样中待测物质的色谱峰保留时间与标准溶液的一致，并且在扣除背景后的试样质谱图中，所选择的离子均出现，而且选择离子的相对丰度与标准物质的进行比较，相对偏差不超过表3规定的范围，可判定为试样中含有对应的待测物。记录定量离子色谱峰的峰面积，以外标法定量。试样溶液中被测物的响应值均应在标准曲线的线性范围之内，超出线性范围的试样溶液可用定容液（4.7）适当稀释后进行测定。
6.3空白试验
除不称取试样外，均按6.1~6.2进行测定。
7试验数据处理
试样中恩诺沙星等15种喹诺酮类抗生素的含量按式（1）计算：
式中：
Xi——试样中被测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
ρi——从标准曲线得到的试样溶液中被测组分的质量浓度，单位为微克每升（μg/L）；
ρ0——从标准曲线得到的空白样品溶液中被测组分的质量浓度，单位为微克每升（μg/L）；
V ——试样溶液首次定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）；
f——稀释倍数。
计算结果保留两位有效数字。
8回收率和精密度
在添加浓度为0.50 mg/kg~5.0 mg/kg范围内，回收率为80%~110%，相对标准偏差小于10%。
9允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。
