GB 5009.296-2023 食品安全国家标准 食品中维生素D的测定 第三法

更新时间:2024-03-22      点击次数:250

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中华人民共和国国家标准

GB 5009.296-2023

食品安全国家标准 食品中维生素D的测定

第三法 液相色谱-串联质谱法

 

16 原理

  试样加入维生素D2和维生素D3的同位素内标后,经氢氧化钾乙醇溶液皂化(含淀粉试样先用淀粉酶酶解) ,正己烷提取,固相萃取柱净化、浓缩后,通过C18柱将维生素D2、维生素D3与其他杂质分离,串联质谱检测,内标法定量。

 

17试剂和材料

  除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。

17.1 试剂

17.1.1无水乙 醇(C2H6O):色谱纯。

17.1.2抗坏血酸(C6H8O6)。

17.1.3 26-二叔丁基对甲酚(C15H24O):简称BHT

17.1.4 氢氧化钾(KOH)。

17.1.5正己烷(C4H14)。

17.1.6 a-淀粉酶(CAS号:9000-90-2,中温淀粉酶,来源于芽孢杆菌属):酶活力>1.5 U/mg

17.1.7甲醇(CH4O):色谱纯。

17.1.8无水硫酸钠(Na2SO4)。

17.1.9乙酸乙酯(C4H8O2)。

17.1.10甲酸(CH2O2):色谱纯。

17.1.11甲酸铵(CH5O2N):色谱纯。

17.2试剂配制

17.2.1 氢氧化钾溶液(50%,质量分数):同3.2.1

17.2.2 BHT-乙醇溶液(0.2 g/100 mL):同3.2.2

17.2.3乙醇-水溶液(2+3):将乙醇和水按2 3的体积比混合均匀。

17.2.4乙酸乙酯-正己烷溶液(1+ 19),将乙酸乙酯与正己烷按1 19的体积比混合均匀。

17.2.5乙酸乙酯-正己烷溶液(3+ 17),将乙酸乙酯与正己烷按3 17的体积比混合均匀。

17.2.6流动相A0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵水溶液:称取0.315g甲酸铵于1000 mL烧杯中,加入1 000 mL水溶解,再加入0.5 mL甲酸,混匀,过滤膜,超声脱气。

17.2.7 流动相B0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液:称取0.315 g甲酸铵于1 000 mL烧杯中,加入1 000 mL甲醇溶解,再加入0.5 mL甲酸,混匀,过滤膜,超声脱气。

17.3 标准品

17.3.1 维生素D2标准品:同3.3.1

17.3.2维生素 D3标准品:同3.3.2

17.3.3维生素 D2-d3内标溶液:100 mg/L

17.3.4维生素 D3-d3内标溶液:100 mg/L

17.4标准溶液配制

17.4.1 维生素D2标准储备溶液(1 000 mg/L):同3.4.1

17.4.2 维生素D3标准储备溶液(1 000 mg/L):同3.4.2

17.4.3 维生素D2标准中间液(100 mg/L):吸取10.00 mL维生素D2标准储备溶液于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,混匀。在-18℃下避光保存,保存期3个月。准确浓度按校正后的浓度折算。

17.4.4维生素 D3标准中间液(100 mg/L :吸取10.00 mL维生素D3标准储备溶液于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,混匀。在-18℃下避光保存,保存期3个月。准确浓度按校正后的浓度折算。

17.4.5 维生素D2和维生素D3混合标准使用液(其中维生素D2质量浓度为2.00 mg/L、维生素D3质量浓度为1.00 mg/L):分别吸取2.00 mL维生素D2标准中间液、1.00 mL维生素D3标准中间液,用流动相稀释并定容至100 mL。在-18℃下避光保存,保存期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。

17.4.6 维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标使用液(维生素D2-d3质量浓度为2.00 mg/L,维生素D3-d3质量浓度为1.00 mg/L):分别吸取200 μL维生素D2-d3内标溶液、100μL维生素D2-d3内标溶液于同一10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成混合内标使用液。在-20℃下避光保存,保存期1个月。

17.4.7 维生素D标准系列工作溶液:分别吸取维生素D混合标准使用液0.10 mL0.20 mL0.50 mL1.00 mL1.50 mL2.00 mL10 mL棕色容量瓶中,各加入维生素D2-d3 和维生素D3-d3混合内标使用液1.00 mL,用甲醇定容至刻度。此标准系列工作溶液浓度中维生素D2质量浓度分别为20.0μg/L40.0μg/L100.0μg/L200μg/L300μg/L400μg/L,维生素D2-d3的质量浓度为200μg/L;维生素D3质量浓度分别为10.0μg/L20.0μg/L50.0μg/L100μg/L150μg/L200μg/L,维生素D-d3的质量浓度为100μg/L。临用前配制。

17.5材料

17.5.1 固相萃取柱硅胶基质6 mL500 mg,或相当者。

17.5.2微孔滤膜:有机系,孔径0.22 μm

 

18仪器和设备

18.1液相色谱申联质谱仪,带电喷雾离子源。

18.2 天平,感量为0.1 mg0.001 g0.01 g

18.3 紫外分光光度计,带1 cm石英比色皿。

18.4磁力搅拌器,带加热、控温功能。

18.5 恒温振荡器。

18.6 多功能振荡器,使用适用于50 mL离心管的适配器,转速≥1 500 r/min

18.7 离心机,使用适用于50 mL离心管的适配器,转速≥8 000 r/min

18.8 旋转蒸发仪。

18.9 氮吹浓缩仪。

18.10超声波清洗器。

 

19 分析步骤

19.1 样品前处理

  处理过程应避免紫外光照射。

19.1.1 试样制备

  将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品袋中,避光冷藏,尽快测定。

19.1.1.1婴幼儿配方食品 特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料

  固体试样:按5.1.1.1制备试样溶液,称取制备后的溶液10 gm3,精确至0.01 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中。并按式(1)计算粉末样品质量(m)。

  液体试样:称取摇匀后的试样10 gm,精确至0.01 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中。

19.1.1.2谷物及其制品、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样

  称取均质后的试样5 g~10 gm,精确至0.01 g)至150 mL平底烧瓶中,加入约20 mL温水(40~45℃),置于磁力搅拌器中搅拌10 min,混匀。婴幼儿谷类辅助食品等难均质的试样,可参考5.1.1.1先制成浆液,再称取制备后的浆液20 g~50 gm3,精确至0.01 g)至150 mL平底烧瓶中。

19.1.1.3油脂及其制品、肉及肉制品、水产及其制品、蛋及蛋制品

  称取均质后的试样0.5 g~2 gm,精确至0.001 g)至50 mL带螺旋盖的离心管,加入8 mL~9.5 mL的温水(40~45℃),混匀。对于难均质的试样,可参考5.1.1.1先制成浆液,再称取制备后的溶液10 gm3,精确至0.01 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中。

19.1.1.4水果、蔬菜、豆类、食用菌、坚果和籽类

  称取均质后的试样10 gm,精确至0.01 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中。千制品称取均质后的试样0.5g~2 g(精确至0.001 g)至50 mL带螺旋盖的离心管,加入8 mL~9.5 mL的温水(40~45℃),置于涡旋振荡器中振荡10 min,混匀。

19.1.1.5含蜂蜡等黏稠胶质试样和其他食品

  称取均质后的试样2 g~20 gm ,精确至0.01 g)至150 mL平底烧瓶。

19.1.2试样皂化

19.1.2.1婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料等试样

  19.1.1.119.1.1.319.1.1.4描述的样品前处理方法称取适量试样于50 mL离心管中,加入100 μL维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标使用液,再加入0.4 g抗坏血酸,涡旋1 min,加入10 mL BHT-乙醇溶液(0.2 g/100 mL),涡旋30 s,再加入5 mL氢氧化钾溶液(50%,质量分数),涡旋混匀后于恒温振荡器中皂化,温度80℃±2℃,时间30 min(或温度25℃±5℃,时间16 h±2 h),皂化后立即用冷水冷却至室温。

19.1.2.2谷物及其制品、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样

  19.1.1.2描述的150 mL平底烧瓶中,加入400 μL维生素D2-d3和维生素D3-d3 混合内标使用液以及1.0g a-淀粉酶,放入1颗磁力搅拌子,加上瓶塞,放入60℃磁力搅拌器中酶解30 min,立即冷却至室温,向酶解液中加入1.0 g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液(0.2 g/100 mL),混匀。再加入10 mL~20mL氢氧化钾溶液(50%,质量分数),边加边振摇,混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化,温度80℃±2 ,时间30 min(或温度25℃±5℃,时间16h±2 h),皂化后立即用冷水冷却至室温。用乙醇-水溶液(2+ 3)将皂化液转移至100 mL的容量瓶中,定容至刻度,摇匀,准确移取25 mL皂化液于50 mL的离心管中。

19.1.2.3 含蜂蜡等胶质样品和其他食品

  19.1.1.5描述的150 mL平底烧瓶中,加入400 μL维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标溶液,加入1.0g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液(0.2 g/100 mL),放入1颗磁力搅拌子,将平底烧瓶置于磁力搅拌器中搅拌10 min,混匀,再加入约20 mL温水(40~45℃),混匀。再加入10 mL~ 20 mL氢氧化钾溶液(50%,质量分数),边加边振摇,混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化,温度80℃±2℃,时间30 min(或温度25℃±5℃,时间16 h±2 h),皂化后立即用冷水冷却至室温。用乙醇-水溶液(2+3)将皂化液转移至100 mL容量瓶中,摇匀,准确移取25 mL皂化液于50 mL离心管中。

19.1.3试样提取

  向上述离心管中加入20 mL正己烷,振荡提取3 min8 000 r/min离心3 min。转移上层清液到另一个50mL离心管,加入25mL水,振荡30s,在8000r/min条件下离心3min,待净化。

19.1.4试样净化

  将固相萃取柱依次用8mL乙酸乙酯、8mL正己烷活化平衡,将上层提取液转移至固相萃取柱净化。用6 mL乙酸乙酯正己烷混合溶液(1+19)淋洗,6 mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液(3+17)洗脱。洗脱液置于40℃下氮吹浓缩装置吹至近干,加入1.0 mL甲醇,超声30 s,涡旋30 s,过0.22 μm微孔滤膜供仪器测定。

  注:为防止将水带入固相萃取柱,上层提取液可留少许正己烷有机相。

19.2 仪器参考条件

19.2.1色谱参考条件

色谱参考条件如下:

a)色谱柱:多环芳烃PAHC18柱长100 mm内径2.1 mm粒径1.8 μm,或相当者;

b)柱温:35℃;

c)流动相:A相,0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵水溶液;B相,0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液;流动相洗脱梯度见表1

d)流速:0.4 mL/min

e)进样量:10 μL

                                             

质谱参考条件

质谱参考条件如下:

a)电离方式:ESI+

b)毛细管电压:3 kV .

c)干燥气温度:375℃;

d)多反应监测(MRM)模式。

监测离子对和碰撞能量见表2,质谱图见图B.4

19.3 标准曲线的制作

  将标准系列工作溶液分别注入液相色谱串联质谱仪中,,以标准系列工作溶液中维生素D2或维生素D3的浓度与相应同位素内标的浓度比值为横坐标,以维生素D2或维生素D3与相应同位素内标的峰面积比值为纵坐标,分别绘制维生素D2、维生素D3标准曲线。维生素D2和维生素D3标准溶液的色谱图参见图B.3

19.4试样溶液的测定

  将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中进行测定。

19.4.1定性分析

  在同样测试条件下,试样溶液中维生素D2、维生素D3的保留时间与标准工作溶液中相应的保留时间相比,偏差在±2.5%以内,且检测到的离子的相对丰度,应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。

19.4.2定量测定

  将试样溶液依次进样,得到试样溶液中维生素D2或维生素D3与其相应内标物的峰面积比值,根据标准曲线得到试样溶液中维生素D2或维生素D3的量。试样溶液中的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围,可以适当减少取样量重新测定。

19.5空白试验

  不称取试样,按样品分析步骤操作,应不含有干扰待测组分的物质。

19.6分析结果的表述

  试样中维生素D2(或维生素D3)的含量,按式(6)和式(7)计算。

image.png

式中:

X——试样中维生素D2(或维生素D3)的含量,单位为微克每百克(μg/100 g);

N——试样溶液中维生素D2 (或维生素D3 )与其同位素内标的峰面积比值对应的质量,单位为

纳克(ng ,按式(7)计算;

100——由每克换算为每百克的换算系数;

m——试样的取样量,单位为克(g);

1 000——由ng换算为μg的换算系数。

式中:

K——从标准曲线查得的质量比;

Nis——试样中加入的内标的质量,单位为纳克(ng)。

  计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留3位有效数字。

  如试样中同时含有维生素D2和维生素D3,维生素D的测定结果以维生素D2和维生素D3的含量之和计算。

19.7 精密度

  在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%

19.8 其他

  当固体试样取样量为2.00 g、定容1.00 mL时,维生素D2的检出限为0.3μg/100 g,定量限为1.00μg/100 g;维生素D3的检出限为0.15μg/100 g,定量限为0.50μg/100 g

  当液体试样取样量为10.00 g、定容1.00 mL时,维生素D2的检出限为0.06μg/100 g,定量限为0.20μg/100 g;维生素D3的检出限为0.03μg/100 g,定量限为0.10μg/100 g


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