中华人民共和国国家标准
GB 5009.285-2022
食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定
前言
本标准代替GB 5413.14-2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》。
本标准与GB 5413.14-2010相比，主要变化如下：
——增加了第一法液相色谱法；
——增加了第二法液相色谱-质谱法；
——删除了规范性引用文件；
——修改了原微生物法为第三法。
1范围
本标准规定了食品中维生素B12的测定方法。
第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素B12的测定。
第二法液相色谱-质谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素B12的测定。
第三法微生物法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素B12的测定。
第二法 液相色谱-质谱法
9 原理
试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和5-脱氧腺苷钴胺素等）转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。
10试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1试剂
10.1.1无水乙酸钠（CH3COONa）。
10.1.2 氢氧化钠（NaOH）。
10.1.2氢氧化钠（NaOH）。
10.1.3乙酸（CH3COOH）。
10.1.4乙腈（CH3CN）：色谱纯。
10.1.5乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。
10.1.6氰化钾或氰化钠（KCN/NaCN）。
10.1.7胃蛋白酶（CAS号：9001-75-6，活力≥400 U/mg）。
10.1.8淀粉酶（活力≥50 U/mg）。
10.1.9乙醇（C2H6O）。
10.2试剂配制
10.2.1乙醇溶液（25%）：量取250 mL乙醇，加水稀释至1 000 mL，混匀。
10.2.2乙酸钠缓冲液（0.25 mol/L）：称取20.5 g无水乙酸钠，用950 mL水溶解并用乙酸调pH至4.0±0.1，用水稀释至1 000 mL。
10.2.3氰化钾（或氰化钠）溶液（10 mg/mL）：称取1.0 g氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用水稀释至100 mL。
注：氰化钾（或氯化钠）为剧毒化学品，操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或使用。
10.2.4氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取4.0 g氢氧化钠，加适量水溶解，并用水稀释至100 mL。
10.2.5乙酸铵溶液（2.5 mmol/L）：称取0.19 g乙酸铵，加适量水溶解，并用水稀释至1 000 mL。
10.2.6乙腈溶液（90%，体积比）：量取100 mL水加于900 mL乙腈中，混匀，超声脱气。
10.3 标准品
10.3.1维生素B12（氰钴胺素）标准品（C63H88CoN14O14P，CAS号：68-19-9）：纯度≥99%，或经国家认证并授子标准物质证书的标准品。
10.3.2维生素B12同位素内标溶液（13C7-C63H88CoN14O14P）：1 μg/mL甲醇溶液。
10.4标准溶液配制
10.4.1维生素B12标准储备溶液（1 mg/mL）：称取10 mg（精确至0.01 mg）维生素B12标准品于50 mL烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至10 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，于-20℃下避光保存，有效期6个月。
10.4.2维生素B12标准中间溶液（10μg/mL）：吸取1.00 mL维生素B12标准储备溶液，置于100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存，有效期1个月。
10.4.3维生素B12标准工作溶液（0.2 μg/mL）：吸取1.00 mL维生素B12 标准中间溶液，置于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存，有效期一周。
10.4.4维生素B12同位素内标工作液（50 ng/mL）：吸取0.5 mL维生素B12同位素内标溶液（1 μg/mL），置于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存。
10.4.5标准系列溶液：分别准确移取0.2 μg/mL 的维生素B12标准工作溶液10 μL、25 μL、50μL、125 μL、250μL和500μL于1 mL容量瓶中，各加入100μL同位素内标工作液（50 ng/mL），用水定容至刻度，摇匀。其中，维生素B12的浓度分别为2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL。维生素B12同位素内标的浓度为5 ng/mL。临用现配。
10.5材料
10.5.1维生素B12免疫亲和柱，柱容量≥800 ng，柱回收率≥85%（验证方法参见附录A）。
10.5.2玻璃纤维滤纸。
10.5.3微孔滤膜：水相，0.22 μm。
11仪器和设备
11.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源（ESI）。
11.2 天平：感量为0.01 g、0.001 g和0.00001 g。
11.3 pH计：精度0.01。
11.4水浴恒温振荡器：温度范围25℃~100℃。
11.5超声波清洗器。
11.6 离心机：转速≥10 000 r/min。
12 分析步骤
注：操作过程应避免紫外光照射，并尽可能避光操作。
12.1样品前处理
12.1.1试样制备
固体样品需粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品测定前振摇混匀。
12.1.2 提取
12.1.2.1 婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品、烘焙食品、即食谷物
称取混匀后的试样1 g~5g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，依次加入100μL同位素内标工作液25 mL乙酸钠缓冲液、0.04 g胃蛋白酶、0.01 g淀粉酶和2 mL氰化钾（或氰化钠）溶液，充分混合。
将样品溶液放入水浴恒温振荡器，在37℃下，振荡酶解30min（肉类样品需酶解10h~16h），酶解后转入100℃水浴中，保持30min，取出冷却至室温。在10000r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。
12.1.2.2 饮料
称取混匀后的试样25 g（精确至0.01 g）于50mL.离心管中，加入100 μL同位素内标工作液，用氢氧化钠溶液调pH至5~7（碳酸饮料需在超声波振荡器中脱气10 min后再调pH），在10 000 r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。
12.1.2.3 果冻
称取混匀后的试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入100 μL 同位素内标工作液，加入40 mL水，涡旋混匀，于70℃水浴中溶解试样，于50℃水浴超声20 min，用氢氧化钠溶液调pH至5~7，在10000r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。
注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的试样，在样品提取时可不使用氰化钾（或氰比钠）。
12.1.3净化
将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，转移全部滤液过柱，调节过柱速度为2 mL/min~3 mL/min。待样液完全过柱后，用10 mL水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置10 mL玻璃试管，用3 mL甲醇分3次洗脱，收集全部洗脱液，在60℃以下用氮气流缓缓吹至近干，用乙酸铵溶液定容至1.0 mL，涡旋30 s溶解残留物，0.22μm滤膜过滤，待测。
注：氰化钾（或氰化钠）废液严禁与酸混合，可加入氢氧化钠调节pH>10，再加入高锰酸钾粉末（按废液质量的3%加入），使氰化物分解，放置24 h后排放。
12.2 仪器参考条件
12.2.1液相色谱参考条件
12.2.1.1色谱柱：C18柱（柱长 100 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径1.7 μm），或相当者。
12.2. 1.2流动相：A相，乙酸铵溶液（2.5 mmol/L）；B相，乙腈溶液（ 90% ，体积比）。
12.2.1.3 洗脱梯度：0 min~0.5min，93% A；0.5 min~2.0 min， 93%~85% A；2.0 min~2.5 min，85%~10% A；2.5 min~3.0 min， 10% A；3.0 min~3.5 min， 10%~ 93% A；3.5 min~6.0 min，93% A。
12.2.1.4流速：0.3 mL/min。
12.2.1.5柱温：40℃。
12.2.1.6进样体积：10 μL。
12.2.2质谱参考条件
12.2.2.1电离方式：ESI+
12.2.2.2离子源温度：350℃。
12.2.2.3锥孔反吹气流量：50 L/h。
12.2.2.4脱溶剂气温度：650℃。
12.2.2.5脱溶剂气流量：900 L/h。
12.2.2.6多反应监测（MRM）模式，锥孔电压和碰撞能量见表1，谱图见附录C中图C.1。
12.3定性测定
在相同的测试条件下，试样溶液中目标化合物的保留时间与相应标准溶液中目标化合物的保留时间相比，偏差在±2.5%以内，且检测到的离子相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致，其允许偏差应符合表2的要求。
12.4标准曲线的制作
将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以维生素B12与其同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以维生素B12的浓度为横坐标绘制标准曲线。
12.5 样品测定
将待测样液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到待测溶液中维生素B12与其同位素内标的峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中维生素B12的浓度。待测液中维生素B12的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应减少取样量，重新按样品分析步骤处理后再进样分析。
12.6空白试验
不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。
13分析结果的表述
试样中维生素B12（以氰钴胺素计）的含量按式（2）计算：
式中：
X——试样中维生素B12的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；
ρ——由标准曲线得到的试样溶液中维生素B12的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样过柱洗脱液的定容体积，单位为毫升（mL）；
100——换算系数；
m——试样的取样量，单位为克（g）；
1 000——换算系数。
计算结果保留两位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
15其他
当取样量为5.00g时，婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品、烘焙食品、即食谷物的检出限为
0.05 μg/100 g，定量限为0.2 μg/100 g。
当取样量为25.00g时，饮料的检出限为0.005 μg/100 g，定量限为0.02 μg/100 g。
当取样量为5.00g时，果冻的检出限为0.03 μg/100 g，定量限为0.1 μg/100 g。
