Inertsil NH2色谱柱操作说明

更新时间:2024-09-19      点击次数:221

1.色谱柱信息

  Inertsi NH2液相色谱柱是在高纯度硅胶基质上键合氨丙基的色谱柱,正相分离模式适合用于维生素等脂溶性化合物的分离,如果用于HILIC分离模式,可以用于强极性至中等极性例如一些极性药物、小生物分子的分离。Inertsil NH2液相色谱柱从硅胶基质的合成,到化学处理和装填后的性能检测,都是在本公司严格的产品控制下进行,因此不同批次的柱与柱之间具有优异的重现性;通过独有的装填技术填装的NH2柱柱床密度均一稳定,从而确保色谱柱具有高柱效,目前NH2柱用于HILIC (亲水性作用,用于反相系统)模式分离的情况愈来愈多,在极性和亲水性化合物如糖类、有机酸、有机碱、氨基酸、多肽水解物等的分离过程中,可作为改变柱选择性和提高分辨率的分离工具。

  为了能长期保持Inertsil NH2液相色谱柱的优越性能和正确的使用色谱柱,在使用色谱柱之前请仔细阅读本说明书。

 

2.使用前的检查与须知事项

●检查包装箱的外观有无异常。

●打开包装,检查色谱柱的填料名称、尺寸规格、连接形式是否相符。

●色谱柱中封存流动相为正己烷/乙醇=982v/v

 

3.色谱柱填料规格

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4.色谱柱安装与操作

  色谱柱在运输过程中,两端用堵头密封。当将色谱柱接入色谱仪器系统时,首先请确保系统中的溶剂和液相柱中封存溶剂是互溶的。如果不能互溶,请采用一种能够与系统及色谱柱都能互溶的溶剂(e.g.异丙醇)对系统进行充分过渡之后再将色谱柱连接到系统中,并注意流动相的方向要与柱上标记的方向保持一致。 我公司提供的常规液相色谱柱标准接头型式为

1/16英寸Waters接头螺丝型(如下左图) 同时还有耐高压液相系统的UP(如下右图) ( 目前NH2柱暂不提供UPLC)。如果需要其他接头形式请另行咨询。

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色谱柱连接好之后,请确认无漏液现象之后再进行后续操作。

  新的NH2柱是保存在正己烷/乙醇(982v/v)的溶液中,在储存和运输过程中,硅胶填料可能会干涸,如果用于正相分离模式,正相柱的平衡时间一般较长,直接用正己烷/乙醇(982 v/v) 冲洗50倍柱体积活化,流速从0.1mL/min缓慢上升到最佳流速,然后用流动相平衡之后再进样分析;如果用在反相系统中分离,推荐用至少50倍柱体积异丙醇过渡(注意接色谱柱之前,用二通代替色谱柱连接系统,用异丙醇将系统包含进样器部分彻底清洗,除水完全之后,再连接色谱柱),再用纯的乙腈冲洗20倍柱体积对色谱柱进行平衡,流速从0.1mL/min缓慢上升到最佳流速,然后用不含缓冲盐的流动相进行平衡20倍柱体积,再用流动相平衡,待压力和基线稳定之后,再进样分析。(如果在活化过程中即发现压力和基线不正常时,请及时联系我公司工程师及时处理。)

 

5.样品与流动相

  为避免色谱柱堵塞,所有样品及溶剂,包括缓冲溶液在内,在使用前必须用0.45 μm或者0.22 μm的滤膜过滤。在正相色谱中,固定相的水分含量常常是影响选择性的关键因素,大部分溶剂都内含有小部分的溶解水分(正己烷20℃水分含量是0.0111% w/w),如发现色谱柱保留性能发生变化,可用流动相低流速长时间充分平衡。

HILIC模式分离中,样品溶剂需要含60-100%的有机溶剂,水的比例应尽量小,推荐5%的水作为自动进样器的清洗液。适用于HILIC分离的缓冲盐体系为甲酸盐和乙酸盐,因为即使再很高比例的有机溶剂中它们也有很好的溶解性。避免使用磷酸盐及其他低溶解性缓冲盐,以防析出堵塞色谱柱。对于大多数分析样品,推荐的缓冲盐浓度为5-20mM。避免使用其他非挥发性缓冲盐、TFA或者离子对试剂,它们会干扰HILIC分离机理,并抑制MS信号。通常的HILIC应用中,一般使用50-95%浓度乙腈的水溶性缓冲盐,如甲酸盐、乙酸盐或者它们的酸作为流动相。流动相使用前请务必进行脱气。

 

6.色谱柱的保养

pH NH2柱可在pH2 ~7.5范围内使用,为保持色谱柱良好的寿命,请避免较强的酸或碱性样品或者流动相进入色谱柱。

●耐压 NH2柱耐受压力为20MPaHP 系列耐压为50MPa 但是正常的压力建议控制在耐受压力的2/3以下。长时间在高压下运行会对色谱柱造成难以修复的损害,因此系统压力升高之后,建议尽快排查系统,如果是色谱柱压力升高,请及时采用适当溶剂冲洗色谱柱。

●温度 最高操作温度为60℃,长时间在高温下操作会显著降低色谱柱寿命。

●冲洗

正相模式清洗步骤:

1. 每次清洗都用低流速起步,当检测到柱压稳定在-定水平后再增加流速;

2. 先用10倍柱体积不含其它添加剂的流动相中的弱溶剂,如正己烷、氯仿等冲洗色谱柱;

3. 50柱体积的诸如乙酸乙酯,二氯甲烷或异丙醇等流动相中的强溶剂冲洗色谱柱。

HILIC模式清洗步骤:

1. 如果是采用缓冲盐流动相的情况下,做样之前请务必用比缓冲盐稍高比例的水充分过渡,然后再用流动相平衡;

2.每天做样完毕之后,应充分冲洗色谱柱,首先用稍高比例的水相冲洗,例如乙腈/=6040 (v/v)冲洗20倍柱体积,然后用乙腈/=955 (v/v)冲洗20倍柱体积,然后保存在这个流动相下。

●储存 色谱柱长期不用,建议冲洗方法完成之后,正相分离模式保存在与出厂封存溶剂相同的流动相中;HILIC分离模式保存在存纯乙腈中,之后卸掉色谱柱,两端用堵头密封,并放在温度变化小的场所。


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