常规反相分析色谱柱柱清洗与再生的推荐步骤：
压力升高，色谱柱峰形发生变化如出现严重拖尾、肩峰甚至峰分岔，分离度降低，这些都强烈提示色谱柱受到污染。可采用以下步骤处理：
1. 如系统接有在线过滤器和保护柱，首先排查在线过滤器与保护柱，进行更新替换。日常操作中，当压力升高10%或柱效降低10%时，就应考虑更换在线过滤器和/或保护柱。
2. 使用高比例的有机溶剂进行冲洗(请注意避免盐析出，通常可使用梯度升高法，然后维持在高比例甚至100%有机溶剂条件下)。此操作通常可洗去大部分污染物。
3. 如有机溶剂清洗不能解决问题，可采用如下方法进行色谱柱的清洗和再生。根据样品性质以及你所了解的污染物性质选择清洗方法，用20倍柱体积(即，对于4.6x250 mm柱，相当于80 mL)的HPLC级溶剂清洗色谱柱，将流动相温度升至35-55℃可提高清洗效率。
极性样品 | 非极性样品 | |
1.水 | 1.异丙醇* | 选择1：连续进几针DMSO(二甲基亚砜)，以溶解柱头析出样品 |
2.甲醇 | 2.THF** | |
3.THF* | 3.二氯甲烷** | 选择2：10-90%B梯度冲洗，其中A为0.1%TFA水溶液，B为0.1%TFA乙腈。 |
4.甲醇 | 4.正己烷 | |
5.水 | 5.异丙醇 | 选择3：使用7M盐酸胍或7M尿素水溶液(配制后膜过滤)冲洗色谱柱，促使柱上吸附蛋白样品变性溶解。 |
6.流动相 | 6. 流动相 |
* 注意防止缓冲盐析出，可调整为适当比例的异丙醇和水的混合溶液
** 除非确保您的系统与*和正己烷完全兼容，否则*或正己烷只有在色谱柱无法用反相有机溶剂如乙腈清洗干净时才考虑使用。降低流速及操作温度，并尽量减少系统在*和正己烷中的暴露时间。
4. 可以考虑对色谱柱进行倒冲，特别是当问题表现为压力急剧升高，提示有颗粒型物质直接堵塞于色谱柱入口端筛板处时。操作时，将色谱柱倒接，并与检测器断开。使用低流速0.2 ml/min，进行过夜冲洗，并封堵检测器入口及出口端以免溶剂挥干产生气泡。甚或，将色谱柱小心的打开，直接更换柱入口端筛板。注意！这类操作需要技巧，仅作问题确实无法得到有效解决时的最后尝试，或供某些经验丰富的分析操作人员参考使用。
