一、引言
桔青霉素（Citrinin，CIT）是一种由青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）某些菌株产生的真菌毒素，广泛存在于小麦、裸麦、大麦、燕麦等农作物中。研究表明，桔青霉素对哺乳动物具有肾脏毒性，可造成肾脏、肝脏、肠道和生殖系统的损伤。2017年，世界卫生组织国际癌症研究机构将其列入3类致癌物清单。红曲霉在产生红曲色素等有益代谢产物的同时，部分菌株也会产生桔青霉素，引发了人们对红曲产品安全性的关注。
为保障食品安全，我国于2016年发布了GB 5009.222-2016《食品安全国家标准 食品中桔青霉素的测定》-。该标准代替了GB/T 5009.222—2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》、SN/T 2426—2010《进出口粮谷中桔霉素含量检测方法 液相色谱法》和SN/T 2916—2011《出口食品中桔霉素的测定方法 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》。与旧版标准相比，主要变化包括：标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中桔青霉素的测定"、增加了净化步骤、扩大了适用范围。本文对该标准的技术要点进行系统解读。
二、标准适用范围
GB 5009.222-2016规定了食品中桔青霉素的测定方法，包含两种方法：
· 第一法（免疫亲和柱净化-高效液相色谱法） ：适用于大米、玉米、辣椒、红曲类产品中桔青霉素的测定。
· 第二法（C₁₈固相萃取小柱净化-高效液相色谱法） ：适用于大米、大麦、燕麦、小麦中桔青霉素的测定。
三、第一法：免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
3.1 方法原理
试样中的桔青霉素用甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，用桔青霉素免疫亲和柱净化。免疫亲和柱内键合有桔青霉素的特异性抗体，样品通过时桔青霉素被抗体选择性吸附，杂质则随淋洗液流出-。随后用洗脱液使抗体变性，将桔青霉素从亲和柱上洗脱下来。净化后的样品采用液相色谱结合荧光检测器测定，外标法定量。
3.2 关键试剂与配制
标准对试剂的纯度有明确要求：甲醇、乙腈、磷酸、冰乙酸均为色谱纯。水为GB 6682规定的二级水。主要试剂配制包括：
· 磷酸溶液（10 mmol/L，pH 7.5） ：移取1.376 mL磷酸加水定容至2000 mL，用2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5。
· 磷酸溶液（10 mmol/L，pH 2.5） ：同样配制后用氢氧化钠调节pH至2.5。
· PBS缓冲溶液（pH 7.0） ：称取8.0 g氯化钠、1.2 g磷酸氢二钠、0.2 g磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾，用水溶解定容至1000 mL。
· 0.1%吐温20-PBS溶液：移取1 mL吐温20以PBS缓冲溶液定容至1000 mL。
· 洗脱液I：甲醇-10 mmol/L磷酸溶液（pH 2.5）（70+30）。
· 洗脱液Ⅱ：甲醇-0.1%磷酸溶液（70+30）。
标准品桔青霉素（C₁₃H₁₄O₅，CAS号：518-75-2）纯度要求≥99.0%。标准储备液浓度为100 μg/mL，于4℃下保存。
3.3 样品前处理
大米、玉米、辣椒：称取粉碎试样10.0 g，加入50 mL甲醇-水（70+30）提取液，高速均质提取2 min。取1.0 mL滤液，加入49 mL 10 mmol/L磷酸溶液（pH 7.5）稀释，玻璃纤维滤纸过滤后待净化。
红曲及其制品：称取试样1.0 g，加入20 mL甲醇-水（70+30）提取液，高速均质提取2 min。取1.0 mL滤液，加入39 mL PBS缓冲溶液稀释。
3.4 净化
大米、玉米、辣椒：取10.0 mL稀释滤液（相当于0.04 g试样）过桔青霉素免疫亲和柱，流速1～2滴/秒。用5 mL 10 mmol/L磷酸（pH 7.5）淋洗后，用1.0 mL洗脱液I洗脱，收集洗脱液供检测。
红曲及其制品：取10.0 mL稀释滤液过柱，用10 mL 0.1%吐温20-PBS溶液淋洗后，用1.0 mL洗脱液Ⅱ洗脱。
3.5 液相色谱条件
大米、玉米、辣椒：C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30℃，流速1.0 mL/min，进样量50 μL；激发波长350 nm，发射波长500 nm；流动相A为乙腈，B为10 mmol/L磷酸（pH 2.5），采用梯度洗脱。
红曲及其制品：C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30℃，流速0.7 mL/min，进样量50 μL；检测波长同上；流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸，梯度洗脱。
3.6 定量与性能指标
采用外标法定量，配制0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL共6个浓度的基质标准工作液制作标准曲线。
方法检出限和定量限因基质而异：大米、玉米、辣椒的检出限为8 μg/kg，定量限为25 μg/kg；红曲及其制品的检出限为25 μg/kg，定量限为80 μg/kg。在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
四、第二法：C₁₈固相萃取小柱净化-高效液相色谱法
4.1 方法原理
用乙腈-异丙醇-水的混合溶液提取试样中的桔青霉素，经C₁₈固相萃取小柱净化后，用配备荧光检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。
4.2 关键试剂与前处理
提取溶剂为乙腈-异丙醇-水（35+10+55），用磷酸调pH至1.5。流动相为乙腈-异丙醇-磷酸溶液（0.08 mol/L）（35+10+55）。
样品经粉碎过830 μm筛后，称取约5 g，加10 mL提取溶剂振荡提取30 min，3500 r/min离心4 min。残渣中再加5 mL提取溶剂重复提取，合并上清液，加水至40 mL并用磷酸调pH至1.5。
4.3 净化与测定
提取液过预淋洗好的C₁₈固相萃取柱，用5 mL水淋洗，减压抽干3 min后，用10 mL甲醇以1.0 mL/min速度洗脱。洗脱液在40℃下氮吹至干，以1.0 mL流动相溶解，过0.22 μm滤膜后供液相色谱测定。
色谱条件：C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温28℃，流速1.0 mL/min，进样量50 μL；激发波长331 nm，发射波长500 nm。桔青霉素保留时间约为9.1 min。
4.4 性能指标
第二法的检出限为3 μg/kg，定量限为10 μg/kg，灵敏度优于第一法。精密度要求与第一法相同。
五、两法对比与选用建议
对比项目 | 第一法 | 第二法 |
净化方式 | 免疫亲和柱 | C₁₈固相萃取小柱 |
适用范围 | 大米、玉米、辣椒、红曲类产品 | 大米、大麦、燕麦、小麦 |
检出限 | 8～25 μg/kg | 3 μg/kg |
定量限 | 25～80 μg/kg | 10 μg/kg |
前处理复杂度 | 较高（免疫亲和柱成本高） | 较低 |
第一法采用免疫亲和柱净化，特异性强、净化效果优异，特别适合红曲类等基质复杂的样品。第二法采用C₁₈固相萃取，操作相对简便、成本较低，灵敏度更高，适合谷物类样品的日常检测。实验室可根据样品类型和检测需求选择合适的方法。
六、结语
GB 5009.222-2016作为食品中桔青霉素检测的强制性国家标准，整合了原有的多项行业标准，建立了以高效液相色谱-荧光检测法为核心、两种前处理方案并行的技术体系。该标准的实施为监管部门、食品生产企业及检测机构提供了统一、规范的技术依据，对保障食品安全、控制红曲类产品及谷物中桔青霉素污染风险具有重要意义。
