一、标准概述
GB 31658.6-2021《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类药物残留量的测定 高效液相色谱法》是由中华人民共和国农业农村部、国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局联合发布的国家标准。该标准按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，系首次发布。标准于2021年9月16日发布，2022年2月1日正式实施，全文共12页。
该标准的发布，为动物性食品中四环素类药物残留的检测提供了统一、规范的技术依据，对于保障食品安全、加强兽药残留监控具有重要意义。
二、制定背景
四环素类药物（包括土霉素、四环素、金霉素、多西环素等）具有抗菌谱广、价格低廉的优点，在畜禽和水产养殖中广泛用作饲料添加剂，以防治疾病和促进生长。然而，这类药物在动物体内易产生累积和残留。
四环素类药物对人体的危害不容忽视。它们易与人体中的钙结合，沉积于骨骼和牙齿中，抑制骨骼和牙齿的生长发育，尤其对胎儿和婴幼儿影响较大，可导致牙齿持久染色变黄；此外，还可在肝脏中沉积，长期累积会造成肝脏和肾脏的损伤。鉴于其健康风险，国家对动物源性食品中的四环素类药物残留限量有严格的规定，配套的残留限量标准为GB 31650-2019《食品中兽药最大残留限量》。GB 31658.6-2021正是为配合限量标准的执行而制定的配套检测方法标准。
三、适用范围
本标准适用于猪、牛、羊、鸡的肌肉、肝脏和肾脏，猪、鸡的皮+脂肪，鸡蛋，牛奶，鱼皮+肉，虾肌肉中四种四环素类药物残留量的检测，具体目标物包括：
· 土霉素（Oxytetracycline）
· 四环素（Tetracycline）
· 金霉素（Chlortetracycline）
· 多西环素（Doxycycline，又称强力霉素）
该标准覆盖了动物性食品的主要品类和养殖动物种类，具有较强的普适性。
四、检测原理与方法
4.1 方法总览
本标准采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作为核心检测手段。检测流程主要包括样品制备、提取、固相萃取净化、液相色谱分离、紫外检测器检测、外标法定量等环节。
4.2 样品前处理
样品前处理是四环素类药物残留检测的关键环节。由于动物性食品基质复杂（含有大量蛋白质、脂肪等干扰物），必须经过充分的提取和净化才能获得可靠的检测结果。
（1）提取
试样经均质后，采用乙二胺四乙酸二钠（EDTA·2Na）-McIlvaine缓冲溶液进行提取。EDTA的加入可与金属离子形成络合物，防止四环素类药物与金属离子螯合而影响提取效率。提取液经离心后取上清液待净化。
（2）固相萃取净化
标准采用两级固相萃取（SPE）净化策略，即使用反相聚合物小柱（如PEP-2、HLB等）和磷酸化聚苯乙烯二乙烯苯高聚物小柱（如LCX）配合使用，以实现动物源性样品的深度净化。
具体净化流程为：提取液先经反相聚合物小柱净化，用甲醇洗脱目标化合物；洗脱液经适当处理后，再上样至LCX固相萃取柱进行二次净化。LCX固相萃取柱的磷酸官能团可通过离子交换作用特异性吸附四环素类药物。最后用草酸乙腈溶液洗脱，收集洗脱液后经氮气吹干、定容、过滤，即可上机检测。
值得注意的是，四环素类药物对热不稳定、见光易分解。因此，在前处理过程中应注意避光操作，氮吹温度一般控制在40℃以下。制备好的上机溶液应在24小时内完成测定。
4.3 液相色谱条件
色谱柱：采用反相C18色谱柱，常用规格为4.6×150 mm，5 μm。
流动相：乙腈与0.01 mol/L草酸溶液的混合溶液，典型比例为25:75（v/v）。草酸的加入有助于改善四环素类药物的色谱峰形，减少拖尾。
检测波长：紫外检测器，检测波长为350 nm或365 nm。
流速：1.0 mL/min。
柱温：30℃。
进样体积：50 μL。
4.4 定量方法
采用外标法进行定量。将待测样品的色谱峰面积与标准溶液的色谱峰面积进行比较，计算样品中四种四环素类药物的残留量。
五、方法学性能指标
5.1 线性范围与相关系数
在0.05~5 μg/mL浓度范围内，土霉素、四环素、金霉素和多西环素的线性相关系数R²均≥0.9994，表明该方法在较宽的浓度范围内具有良好的线性关系。
5.2 检出限与定量限
方法的检出限（LOD）可低至0.5 μg/kg级别，定量限（LOQ）可达1.5 μg/kg。不同基质和不同药物可能略有差异，但整体灵敏度较高，完全能够满足残留监控的需求。
以土霉素为例，方法检出限可低至12 μg/kg，远低于GB 31650中规定的限量值（土霉素40 μg/kg、四环素100 μg/kg）。
5.3 回收率与精密度
方法在添加浓度0.4 mg/kg（400 μg/kg）水平下，基质加标回收率可达85%以上。10 μg/mL混合标准溶液连续进样5针，峰面积RSD＜2%，表明仪器精密度良好。
六、检测关键点与注意事项
6.1 四环素类药物的化学不稳定性
四环素类化合物在不同pH条件下以不同形态存在：
· pH＜2时，以脱水四环素类形式存在；
· 2＜pH＜6时，以差向四环素类形式存在；
· pH＞9时，会发生内酯化现象。
因此，在整个检测过程中严格控制溶液的pH值至关重要。
此外，四环素类药物热稳定性较差、见光易分解。建议标准储备液（100 μg/mL）在-18℃以下避光保存，有效期1个月；混合标准工作液现用现配。
6.2 固相萃取环节的优化
在实际应用中发现，标准中固相萃取步骤可能存在回收率不理想的情况。主要原因有两方面：
一是上样液有机相比例过大，洗脱能力太强，导致目标物在LCX固相萃取柱上吸附不充分；二是四环素类抗生素离子化不充分，与LCX固相萃取柱磷酸官能团的结合效率低。
针对这些问题，可采取以下优化措施：
· 将甲醇洗脱液中的2 mL水替换为2 mL 8 mM磷酸二氢钠水溶液（pH 5.0） ，通过调节pH增强填料对药物的吸附效率；
· 最后定容时直接用草酸溶液（0.01 M） 定容至2 mL，消除溶剂效应。
6.3 与相关标准的衔接
GB 31658.6-2021是GB 31650-2019《食品中兽药最大残留限量》的配套检测方法标准。实际检测中，应根据GB 31650规定的限量值进行结果判定。例如，羊肝、肾组织中四环素类药物的限量值均为100 μg/kg。
此外，四环素类药物残留还可采用GB 31658.17-2021（同时测定四环素类、磺胺类和喹啉酮类）等其他标准进行检测。实验室可根据具体检测需求和仪器配置选择适当的方法。
七、总结
GB 31658.6-2021作为动物性食品中四环素类药物残留检测的专项国家标准，具有以下突出特点：
一是覆盖面广。涵盖了猪、牛、羊、鸡、鱼、虾等多种动物源食品以及肌肉、肝脏、肾脏、脂肪、鸡蛋、牛奶等多种基质。
二是目标物明确。针对土霉素、四环素、金霉素、多西环素四种最常用的四环素类药物进行检测。
三是方法可靠。采用高效液相色谱法配合两级固相萃取净化，灵敏度高、重现性好，方法学指标满足残留监控要求。
四是可操作性强。标准对样品制备、提取、净化、色谱条件等各环节均有明确规定，便于实验室实施。
该标准的实施，为监管部门开展兽药残留监测、保障动物性食品安全提供了有力的技术支撑，也为相关检测实验室提供了规范的操作依据。
