中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 2222-2008 进出口动物源性食品中糖皮质激素类兽药残留量检测方法
液相色谱-质谱_质谱法
前 言
本标准的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局负责起草。
本标准主要起草人：林维宣、谢文、康庆贺、孙兴权、肖珊珊、田苗、奚君阳、于灵。
本标准系首ci发布的出入境检验检疫行业标准。
1 范围
本标准规定了进出口动物源性食品中曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、地塞米松、氟米松、曲安奈德残留量测定液相色谱-质谱/质谱检测方法。
本标准适用于猪肉、猪肾中糖皮质激素类兽药残留量的检测和确证。
2 方法提要
样品先加入醋酸铵缓冲溶液和β-盐酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酸酯酶水解，再用乙酸乙酯提取，提取液经HLB固相萃取小柱净化，液相色谱-质谱/质谱测定和确证，外标法定量。
3 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
3.1乙腈：高效液相色谱级。
3.2 正已烷：高效液相色谱级。
3.3 乙酸乙酯：高效液相色谱级。
3.4 甲醇：高效液相色谱级。
3.5 乙酸铵。
3.6 冰乙酸。
3.7 无水硫酸钠：650℃灼烧4 h，在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。
3.8β-盐酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酸酯酶：含β-盐酸葡萄糖醛甙酶134600U/mL，芳基硫酸酯酶
5 200 U/mL。
3.9 甲醇水(3+7，体积比)：30 mL甲醇与70 mL水混合。甲醇水(1+1，体积比)。
3. 10 甲醇水(5+5，体积比)：50 mL甲醇与50 mL水混合。
3.11 0.02 mol/L醋酸铵缓冲溶液：溶解1.54 g醋酸铵于950 mL水中，用冰乙酸调节溶液pH值到5.2，最后用水稀释至1 L。
3. 12 标准品纯度大于等于97%。标准品信息见附录A表A.1。
3.13 糖皮质激素标准储备溶液：称取适量标准品(3. 12)，用甲醇溶解配制成浓度为100μg/mL的标准储备溶液，-18℃冷冻保存，有效期3个月。
3.14 标准工作溶液：根据需要用空白样品溶液将标准储备液稀释成地塞米松溶液浓度分别为1、2、4、6和8 ng/mL，泼尼松龙的溶液浓度(猪肉)分别为6、8、16、24和40 ng/mL，曲安西龙、氢化可的松、泼尼松、氟米松、曲安奈德混合溶液浓度分别为10、20、40、80和100 ng/mL。临用前现配。
3. 15 无水硫酸钠柱：80mm×40mm(内径)筒形漏斗，底部垫5 mm脱脂棉，再装40 mm无水硫酸钠。
3. 16 固相萃取柱：Oasis(HLB) 500 mg，或相当者。
3. 17 有机相微孔滤膜：0.45 μm。
4 仪器和设备
4.1高效液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源。
4.2旋转蒸发器。
4.3粉碎 机。
4.4 均质器。
4.5旋涡混合器。
4.6离心机：7 000 r/ min. .
4.7氮吹仪。
4.8 天平：感量为0.01 g和0.0001 g。
4.9 固相萃取装置。
4.10恒温箱。
5试样制备与保存
从所取全部样品中取出有代表性样品约500 g，用粉碎机粉碎，混合均匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样于-18 ℃冷冻保存。
在抽样和制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。
6测定步骤
6.1 提取
称取5 g试样(精确到0.01 g)置于50 mL具塞塑料离心管中，加1.5 mL甲醇，再加入23.5 mL醋酸铵缓冲溶液(3.11)和40μLβ-盐酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酸酯酶(3.8)，以2000r/min混匀1min，于恒温箱中37℃培养16 h，以6 000 r/min离心5 min，量取10.0 mL上清液，加入20 mL乙酸乙酯，以2000 r/ min 混匀1 min，以4 000 r/min离心5 min，将上层乙酸乙酯提取液过无水硫酸钠柱，滤液收集于浓缩瓶中，样品残渣再加入20 mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并乙酸乙酯提取液，在45 ℃以下水浴减压浓缩至近干。
6.2 净化
Oasis HLB柱(3.16)使用前依次用5 mL甲醇和5 mL水预洗。用5 mL醋酸铵缓冲溶液(3.11)溶解残渣，将溶液转移至Oasis HLB柱，弃去流出液，用5 mL水和5 mL甲醇水溶液(3.9)依次洗涤，弃去流出液，负压抽干，8 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，在50℃以下水浴减压浓缩至近干，用1.0 mL甲醇水(3.10)定容，混匀，将溶液通过0.45 μm滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
6.3 测定
6.3.1液相色谱质谱/质谱条件
a) 色谱柱：C8柱，150 mm×4.6 mm(内径)，5μm或相当者；
b)流动相：乙腈-水，梯度见表1；
c) 流速：0.4 mL/ min；
d) 进样量：50 μL；
e)离子源：电喷雾离 子源；
f) 扫描方式：正离子扫描；
g) 检测方式：多反应监测；
h) 雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件参见附录B；
i)监测离 子对(m/z)：参见附录B表B. 1。
6.3.2高效液相色谱-质谱/质谱测定
根据试样中被测样液的含量情况，选取待测物的响应值在仪器线性响应范围内的浓度进行测定，如超出仪器线性响应范围应进行稀释。在上述色谱条件下曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、地塞米松、氟米松、曲安奈德的参考保留时间约分别为9.0、11.9、12.1、12. 2、13. 7、14.0、14.8 min，标准溶液的选择性离子流图参见附录C中图C.1。
6.3.3 液相色谱-质谱/质谱确证
按照液相色谱质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中待测物质的保留时间偏差在±2.5%之内。定量测定时采用标准曲线法。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。
6.3.4 空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。
7结果计算和表述
用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中糖皮质激素残留含量，计算结果需扣除空白值：
式中：
X ——试样中糖皮质激素类残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
ci——从标准曲线上得到的糖皮质激素溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；
m——最终样液代表的试样质量，单位为克(g)。
8测定低限(LOQ)和回收率
8.1测定低限(LOQ)
猪肉：地塞米松方法测定低限为0.75μg/kg，泼尼松龙方法测定低限为4μg/kg，曲安西龙、氢化可的松、泼尼松、氟米松、曲安奈德方法测定低限为10μg/kg。
猪肾：地塞米松方法测定低限为0.75μg/kg，曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、氟米松、曲安奈德方法测定低限为10μg/kg。
8.2 回收率
在不同添加浓度的回收率数据见表3。
