中华人民共和国国家标准
农业农村部公告第197号-10-2019
畜禽血液和尿液中160种兽药及其它化合物的测定
液相色谱-串联质谱法
前言
本标准按照GB/T 1. 1-2009 给出的规则起草。
请注意本文件某些内容可能涉及专li。本文件发布机构不承担识别这些专li的责任。
本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76） 归口。
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所。
本标准主要起草人：杨曙明、赵燕、郄梦洁、王雪、陈爱亮、徐贞贞、邱静。
1范围
本标准规定了猪血、牛血、 羊血和鸡血及猪尿、牛尿、羊尿中160种兽药及其他化合物的液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于猪血、牛血、羊血和鸡血及猪尿、牛尿、羊尿中160种兽药及其他化合物的
测定。
本标准畜禽血液和尿液中160种兽药及其他化合物图测定方法检出限为0.3μg/L~2μg/L，定量限为1μg/L~5μg/L，每种兽药或其他化合物的检出限和定量限参见附录A。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不ke少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 1897动物及动物产品兽药残留监控抽样规范
3原理
用乙腈在弱酸性条件从畜食血液和尿液中提取兽药及其他化合物，经QuEChERS方法净化，利用液相色谱-串联质谱进行检测，采用基质匹配法校准，外标法定量。
4试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂。
4.1水： GB/T 6682规定的一级水
4.2 甲醇：色谱纯
4.3乙腈： 色谱纯。
4.4甲酸： 色谱纯。
4.5 QuEChERS 盐析包：每份含4g硫酸钠及1 g氯化钠。
4.6除脂分散净化剂 [QuEChERS dSPE EMR Lipid （5982-1010）]。
4.7 EDTA- McIIvaine缓冲液：分别称取无水磷酸氢二钠10.9g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）
3g，柠檬酸12.9 g，加水溶解并定容至1 000 mL。
4.8 50%甲醇溶液：准确移取10 mL甲醇，用水定容至20 mL。
4.9 2mol/L乙酸铵溶液：称取15.42 g乙酸铵，用水溶解并定容至100 mL。
4.10 流动相A：准确量取2 mL，甲酸和1 mL 2mol/L乙酸铵溶液（4.9），用水定容至1000mL。
4.11 流动相B：准确量取2 mL甲酸，用甲醇定容至1000mL。
4.12 兽药及其他化合物标准物质：参见附录A。
4.13各组混合标准储备溶液 （100μg/mL）：参照附录A的分类，分别精密称取一定量的兽药及其他化合物标准品于100 mL容量瓶中，用附录A中推荐溶剂，溶解并定容。其中，解热镇痛类（4 种）、咪唑与苯并咪唑类-1 （12 种）、中枢神经类（6 种）、咪唑与苯并咪唑类-2 （18 种）、非甾抗炎类（9种）、青霉素类（1种）、精神类（5种）、喹诺酮类（18种）、甾体激素类（25种）、兴fen剂类（3 种）、磺胺类（21种）、β受体激素类（13种）混合标准储备液避光在-20℃以下保存，有效期为一年。抗真菌类（2种）、抗组胺类（9种）、大环内酯类抗生素（4种）、聚醚类抗生素（1种）、其他化合物类（9种）混合标准储备液避光在-20℃以下保存，有效期为2个月。
4.14 全混合标准工作溶液（4μg/mL）：准确量取各组混合标准储备液（4.13） 适量于10mL容量瓶中，用50%甲醇溶液（4.8）稀释并定容，该溶液在-20℃以下避光保存，有效期为5 d。
5仪器设备
5.1 液相色谱-串联质谱：配有电喷雾离子源。
5.2 天平：感量0.00001 g及感量0.01 g。
5.3涡旋混合仪。
5.4离心机： 转速不低于9500 r/min。
5.5 氮吹仪。
5.6针筒式滤膜过滤器： 孔径0. 22μm，有机系。
6样品
样品按照NY/T 1897的规定进行取样。以不含待测兽药及其他化合物样品为空白样品。所采集样品应在-20℃ 以下保存。试验前取适量恢复至室温的样品，混匀备用。
7试验步骤
7.1 试样的处理与净化
平行做2份试验，准确移取试样2 mL置于50 mL离心管中，加入3 mL EDTA-McIIvaine缓冲液（4.7），涡旋混匀1 min，准确加入10 mL乙腈，再涡旋混匀1 min，加入1 g QuEChERS盐析包（4.5），涡旋混匀1 min，静置10 min盐析分层，9 500 r/min条件下离心10 min，准确量取8 mL上层清液（相当于1.6 mL试样量）于15 mL离心管中，在40℃水浴条件下氮吹至近干，准确加入乙腈2mL，涡旋混合，待净化用。
称取含0.5g除脂分散净化剂（4.6） 于净化管，加入2mL水，混匀、活化后，将净化剂转移至待净化试样溶液中。涡旋混匀1 min，在9500 r/min条件下离心5 min，取上清液过针筒式滤膜过滤器（5. 6），供液相色谱-串联质谱分析测定。
7.2基质匹配混合标准 系列溶液
取若干份空白试样，按7.1步骤处理与净化。然后用该空白试样溶液和全混合标准工作溶液（4.14）配制成浓度为1ng/mL~100ng/ mL基质匹配的混合标准系列溶液，供液相色谱-串联质谱分析测定。该系列溶液需临用现配。
7.3参考液相色谱-串联质谱条件
7.3.1液相色谱参考条件
色谱柱： C18柱，长度150 mm，内径3.0 mm，粒径1.8μm，或性能相当者。
柱温： 40℃。
进样量： 2μL。
流速： 0.4 mL/min。
流动相A： 0.2%甲酸+2 mmol/L乙酸铵水溶液（4.10）； 流动相B： 0.2%甲酸的甲醇溶液
（4. 11），梯度洗脱程序见表1。
7.3.2质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源（ESI）
电离源极性：正模式。
监测模式：多反应监测模式。
干燥气温度： 250℃。
干燥气流速： 7L/min。
雾化气压力：35 psi。
7.4 测定
7.4.1 定性
在上述规定的色谱质谱条件下，分别对基质匹配的混合标准系列溶液和试样溶液进行测定。160种兽药及其他化合物的毛细管电压及碰撞电压等相关信息参见附录B，其在多反应监测模式下的标准溶液（50μg/L）色谱图参见附录C。
在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，偏差在2.5%之内；并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在该兽药或相关化合物。
表2 定性分析时相对离子丰度的最大允许相对偏差
| 相对离子丰度 | ＞50 | 20-50（含） | 10~20（含） | ≤10 |
| 允许的相对偏差 | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
7.4.2 定量
本标准中液相色谱-串联质谱采用基质匹配标准曲线校准、外标法定量。160 种兽药及其他化合物的基质匹配标准曲线的相关系数应大于或等于0.99。所测样品中兽药及其他化合物的响应值应均在该标准曲线的线性范围内。若超出该线性范围，则需减少试样量重新试验或将试样溶液和基质匹配标准溶液做相应稀释后重新测定。
8试验数据处理
畜禽血液和尿液中兽药及其他化合物的含量以其在试样中的质量分数计，按式（1）计算。
式中：
ω——畜禽血液和尿液中兽药及其他化合物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——提取时所加乙腈的体积，单位为毫升（mL）；
V3——上机前定容体积，单位为毫升（mL）；
V——试样体积，单位为毫升（mL）；
V2——氮吹前所取溶液的体积，单位为毫升（mL）。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
9精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果与其平均值的绝对差值不大于该平均值的25%。
