中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2741-2015
仁果类水果中类黄酮的测定
液相色谱法
1范围
本标准规定了液相色谱法测定仁果类水果中类黄酮的方法。
本标准适用于仁果类水果（苹果、梨和山楂）中主要类黄酮含量的测定。
本标准的方法检出限和定量限见附录A。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不ke少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
仁果类水果中的类黄酮物质经乙醇溶液超声提取后，经固相萃取小柱净化，在反相C18色谱柱上分离后，用紫外/二极管阵列检测器检测，外标法定量。
4试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。
4.1试剂
4.1.1 盐酸（HCI）：优级纯。
4.1.2甲酸（CH2O2）：色谱纯。
4.1.3甲醇（CH4O）：色谱纯。
4.1.4乙醇（C2H6O）。
4.1.5乙腈（C2H3N）：色谱纯。
4. 1.6 80%乙醇溶液：取乙醇（4.1.4）800 mL，加入200 mL水，超声2 min混匀。
4.2标准品
23种类黄酮标准品：纯度≥98% ，名称见附录A。
4.3标准溶液配制
4.3.1单一组分标准溶液：准确称取类黄酮标准品各5.0mg，甲醇定容至10.0mL，配制成500mg/L标准储备液，-18℃以下贮存，备用。
4.3.2混合标准溶液：混合标准溶液分为3组，其中组Ⅰ和组Ⅲ用于苹果和山楂果实中类黄酮的定量，组Ⅱ和组Ⅲ用于梨果实中类黄酮的定量。按照附录A中组别，根据各种黄酮类物质在仪器上的响应值逐一吸取一定体积的单一组分标准溶液配制成混合标准溶液，再稀释成不同质量浓度的混合标准溶液，用于制作标准工作曲线，混合标准溶液现用现配。
4.4 材料
4.4.1有机相微孔滤膜：0.22μm。
4.4.2 C18固相萃取小柱：200 mg，6mL。
5仪器
5.1液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
5.2电子天平：感量为0.01 g和0.0001g。
5.3离心机：可达8000r/min以上。
5.4超低温冰箱：（-80±5）℃。
5.5超声波清洗器：40 kHz。
5.6旋转蒸发仪：带有温度控制。
6试样的制备
果实洗净擦干，取可食部分切碎混匀，四分法取约250g，液氨冷冻，研成粉末，-80℃贮存备用。
7分析步骤
7.1 提取
称取10 g试样（精确到0.01 g）于50.0 mL棕色离心管中，加入约25 mL 80%乙醇溶液（4.1. 6），混合，室温下超声15min，8000r/min离心5min，上清液转入50.0mL棕色容量瓶中，残渣再用约15mL 80%乙醇溶液按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，用80%乙醇溶液定容至50.0 mL，备用。
7.2浓缩
准确吸取10mL提取液（7.1）于100mL旋转蒸发瓶中，35℃下减压蒸发除去乙醇，浓缩至约3mL。
7.3 净化
C18固相萃取小柱（4.4.2）依次用约5 mL甲醇和约5 mL水预淋洗、活化后，将7. 2浓缩液加至小柱中，旋转蒸发瓶用5mL水清洗，清洗液转入小柱中，抽滤，弃除滤液。再用约8mL甲醇分2次清洗旋转蒸发瓶，清洗液加入到小柱中，收集滤液，甲醇定容至10.0mL，过滤膜（4.4.1），待测定。
7.4试剂空白试验
仅不加入样品，其他提取、浓缩和净化过程同样品相同。
7.5 测定
7.5.1色谱参考条件
检测波长：280nm、360nm和520nm，各组分定量波长见附录A。
色谱柱：C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，颗粒度5μm，或性能类似的色谱柱。
柱温：40℃。
流速：0.8 mL/min。
流动相A：20%甲酸；流动相B：100%乙腈。
进样量：10μL。
流动相梯度洗脱程序见表1。
7.5.2 仪器测定
取标准工作溶液、样品待测液（7.3）及试剂空白（7.4）进样测定，以色谱峰保留时间定性，以标准工作液多点校准定量。试剂空白不能检出有对被测组分有干扰的物质。
8结果计算
样品中类黄酮物质以质量分数X计，按式（1）计算。
式中：
X——样品中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/ kg）；
ρ——标准曲线计算出试样提取液中各组分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V——试样 提取液定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）。
计算结果保留小数点后两位。
9色谱图
类黄酮标准溶液色谱图参见附录B。
10 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。
