中华人民共和国国家标准
GB 5009.82-2016
食品安全国家标准
食品中维生素A、D、E的测定
前言
本标准代替GB/T 5009.82-2003《食品中维生素A和维生素E的测定》、GB 5413.9-2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定》、GB/T 9695.26-2008《肉与肉制品 维生素A含量测定》、GB/T 9695.30-2008《肉与肉制品维生素 E含量测定》、NY/T 1598-2008《食用植物油中维生素E组分和含量的测定 高效液相色谱法》。
本标准与GB/T 5009.82-2003 相比，主要变化如下：
——标准名称修改为“食品安全国家标准食品中维生素 A、D、E的测定"；
——增加了“食品中维生素E的测定 正相高效液相色谱法"；
——增加了“食品中维生素D的测定 液相色谱-串联质谱法"；
——增加了“食品中维生素D的测定 高效液相色谱法"；
——修改了“食品中维生素A和维生素E的测定 反相高效液相色谱法"；
——修改了维生素E异构体的反相色谱分离条件，可同时分离测定4种生育酚异构体；
——删除了苯并芘内标定量法，改用外标法定量；
——删除了“比色法"测定维生素A。
1范围
本标准规定了食品中维生素A、维生素E和维生素D的测定方法。
本标准第一法适用于食品中维生素A和维生素E的测定。
本标准第二法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素E的测定。
本标准第三法适用于食品中维生素D2和维生素D3的测定。
本标准第四法适用于配方食品中维生素D2或维生素D3的测定。
第一法 食品中维生素A和维生素E的测定 反相高效液相色谱法
2原理
试样中的维生素A及维生素E经皂化（含淀粉先用淀粉酶酶解）、提取、净化、浓缩后，C30或PFP反相液相色谱柱分离，紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1 无水乙醇（C2H5OH）：经检查不含醛类物质，检查方法参见A.1。
3.1.2抗坏血酸（C6H8O6）。
3.1.3 氢氧化钾（KOH）。
3.1.4 乙（yi）醚[(CH3CH2)2O]：经检查不含过氧化物，检查方法参见A.2。
3.1.5石油醚（C5H12O2）：沸程为30℃~60℃。
3.1.6 无水硫酸钠（Na2SO4）。
3.1.7 pH试纸（pH范围1~14）。
3.1.8 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.9 淀粉酶：活力单位≥100 U/mg。
3.1.10 2，6-二叔丁基对甲酚（C15H24O）：简称BHT。
3.2试剂配制
3.2.1 氢氧化钾溶液（50 g/100 g）：称取50 g氢氧化钾，加入50 mL水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。
3.2.2 石油醚-乙（yi）醚溶液（1+1）：量取200 mL石油醚，加入200 mL乙（yi）醚，混匀。
3.2.3 有机系过滤头（孔径为0.22μm）。
3.3 标准品
3.3.1维生素 A标准品
视黄醇（C20H30O，CAS号：68-26-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2 维生素E标准品
3.3.2.1 ɑ-生育酚（C29H50O2，CAS号：10191-41-0 ）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.2 β-生育酚（C28H48O2，CAS号：148-03-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.3 Y-生育酚（C28H48O2，CAS号：54-28-4）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2.4 δ-生育酚（C27H46O2，CAS号：119-13-1）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1 维生素A标准储备溶液（0.500 mg/mL）：准确称取25.0 mg维生素A标准品，用无水乙醇溶解后，转移入50 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为0.500 mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在-20℃下避光保存，有效期1个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录B）。
3.4.2维生素 E标准储备溶液（1.00 mg/mL）：分别准确称取ɑ-生育酚、β-生育酚、Y-生育酚和δ-生育酚各50.0 mg，用无水乙醇溶解后，转移入50 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为1.00 mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在-20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃ ，并进行浓度校正（校正方法参见附录B）。
3.4.3维生素A和维生素E混合标准溶液中间液：准确吸取维生素A标准储备溶液1.00 mL和维生素E标准储备溶液各5.00 mL于同一50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此溶液中维生素A浓度为10.0 μg/mL，维生素E各生育酚浓度为100 μg/mL。在-20℃下避光保存，有效期半个月。
3.4.4维生素A和维生素E标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准溶液中间液0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，该标准系列中维生素A浓度为0.20 μg/mL.0. 50 μg/mL、1.00 μg/mL. 2.00 μg/mL、4.00 μg/mL、6.00 μg/mL，维生素E浓度为2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0μg/mL、40.0 μg/mL、60.0 μg/mL。临用前配制。
4仪器和设备
4.1 分析天平：感量为0.01 mg。
4.2 恒温水浴振荡器。
4.3旋转蒸发仪。
4.4氮吹仪。
4.5 紫外分光光度计。
4.6分液漏斗萃取净化振荡器。
4.7高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器。
5分析步骤
5.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。
5.2 试样处理
警示：使用的所有器皿不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作；提取过程应在通风柜中操作。
5.2.1 皂化
5.2.1.1不含淀粉样品
称取2 g ~5 g（精确至0.01 g）经均质处理的固体试样或50 g（精确至0.01 g）液体试样于150 mL 平底烧瓶中，固体试样需加入约20 mL温水，混匀，再加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT，混匀，加入30 mL无水乙醇，加入10 mL~20 mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于80℃恒温水浴震荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。
注：皂化时间一般为30min，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。
5.2.1.2含 淀粉样品
称取2 g~5 g（精确至0.01 g）经均质处理的固体试样或50 g（精确至0.01 g）液体样品于150 mL平底烧瓶中，固体试样需用约20 mL温水混匀，加入0.5 g~1 g淀粉酶，放入60℃水浴避光恒温振荡30 min后，取出，向酶解液中加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT ，混匀，加入30 mL无水乙醇，10 mL~20mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。
5.2.2提取
将皂化液用30 mL水转入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚-乙（yi）醚混合液，振荡萃取5 min，将下层溶液转移至另一250 mL的分液漏斗中，加入50 mL的混合醚液再次萃取，合并醚层。
注：如只测维生素A与ɑ-生育酚，可用石油醚作提取剂。
5.2.3洗涤
用约100 mL水洗涤醚层，约需重复3次，直至将醚层洗至中性（可用pH试纸检测下层溶液pH值），去除下层水相。
5.2.4浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约3g）滤入250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用约15 mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚液剩下约2 mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度。溶液过0.22 μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。
5.3色谱参考条件
色谱参考条件列出如下：
a） 色谱柱：C30柱（柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径3 μm），或相当者；
b） 柱温：20℃；
c） 流动相：A：水；B：甲醇，洗脱梯度见表1；
d） 流速：0.8 mL/min；
e） 紫外检测波长：维生素A为325 nm；维生素E为294 nm；
f） 进样量：10 μL；
g） 标准色谱图和样品色谱图见C.1。
注1：如难以将柱温控制在20℃±2℃，可改用PFP柱分离异构体，流动相为水和甲醇梯度洗脱。
注2：如样品中只含ɑ-生育酚，不需分离β-生育酚和γ-生育酚，可选用C18柱，流动相为甲醇。
注3：如有荧光检测器，可选用荧光检测器检测，对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性，可按以下检测波长检测：维生素A激发波长328 nm，发射波长440 nm；维生素E激发波长294 nm，发射波长328 nm。
5.4标准曲线的制作
本法采用外标法定量。将维生素A和维生素E标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。
5.5 样品测定
试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。
6分析结果的表述
试样中维生素A或维生素E的含量按式（1）计算：
式中：
X——试样中维生素A或维生素E的含量，维生素A单位为微克每百克（μg/100g），维生素E单位为毫克每百克（mg/100g）；
ρ——根据标准曲线计算得到的试样中维生素A或维生素E的浓度，单位为微克每毫升
（μg/mL）；
V——定容体积，单位为毫升（mL）；
f——换算因子（维生素A：f=1；维生素E：f=0.001）；
100——试样中量以每100克计算的换算系数；
m——试样的称样量，单位为克（g）。
计算结果保留三位有效数字。
注：如维生素E的测定结果要用ɑ-生育酚当量（ɑ-TE）表示，可按下式计算：维生素E（mg ɑ-TE/100 g）=ɑ-生育酚（mg/100 g）+β-生育酚（mg/100 g）×0.5+ Y-生育酚（mg/100 g）×0.1十+δ-生育酚（mg/100 g）×0.01。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8其他
当取样量为5 g，定容10 mL时，维生素A的紫外检出限为10 μg/100g，定量限为30 μg/100 g；生育酚的紫外检出限为40 μg/100 g，定量限为120 μg/100 g。
第二法食品中维生素 E的测定正相高 效液相色谱法
9原理
试样中的维生素E经有机溶剂提取、浓缩后，用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离，经荧光检测器检测，外标法定量。
10试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 无水乙醇（C2H5OH）：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见A.1。
10.1.2 乙(yi)醚[（CH3CH2）2O]：分析纯，经检验不含氧化物，检查方法参见A.2。
10.1.3石 油醚（C5 H12O2）：沸程为30℃~ 60℃。
10.1.4 无水硫酸钠（Na2SO4）。
10.1.5 正己烷（n-C6H14）：色谱纯。
10.1.6 异丙醇[（CH3）2CHOH]：色谱纯。
10.1.7叔丁基甲基醚[CH3OC（CH3）3]：色谱纯。
10.1.8 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
10.1.9 四氢呋喃（C4H8O）：色谱纯。
10.1.10 1，4-二氧六环（ C4H8O2）：色谱纯。
10.1.11 2，6-二叔丁基对甲酚（C15H24O）：简称BHT。
10.1.12 有机系过滤头（孔径为0.22 μm）。
10.2试剂配制
10.2.1石油醚-乙(yi)醚溶液（1+1）：量取 200 mL石油醚，加入200 mL乙(yi)醚，混匀，临用前配制。
10.2.2 流动相：正己烷+[叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液（20+1+0.1）]= 90+10，临用前配制。
10.3 标准品
10.3.1 ɑ-生育酚（C29H50O2，CAS号：10191-41-0 ）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；
10.3.2 β-生育酚（C28H48O2，CAS号：148-03-8）： 纯度≥95% ，或经国家认证并授予标准物质证书的标.准物质；
10.3.3 Y-生育酚（C28H48O2，CAS号：54-28-4）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；
10.3.4 δ-生育酚（C27H46O2，CAS号：119-13-1）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液配制
10.4.1维生素E标准储备溶液（1.00 mg/mL）：分别称取4种生育酚异构体标准品各50.0 mg（准确至0.1 mg），用无水乙醇溶解于50 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为1.00 mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在-20℃下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校正（校正方法参见附录B）。
10.4.2 维生素E标准溶液中间液：准确吸取维生素E标准储备溶液各1.00 mL于同一100 mL容量瓶中，用氮气吹除乙醇后，用流动相定容至刻度，此溶液中维生素E各生育酚浓度为10.00 μg/mL。密封后，在-20℃下避光保存，有效期半个月。
10.4.3 维生素E标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素E混合标准溶液中间液0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，该标准系列中4种生育酚浓度分别为0.20 μg/mL.0.50 μg/ mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/ mL、4.00 μg/mL、6.00 μg/mL。
11仪器和设备
11.1 分析天平：感量为0.1 mg。
11.2 恒温水浴振荡器。
11.3 旋转蒸发仪。
11.4 氮吹仪。
11.5 紫外分光光度计。
11.6索氏脂肪抽提仪或加速溶剂萃取仪。
11.7高效液相色谱仪，带荧光检测器或紫外检测器。
12分析步骤
12.1 试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。
12.2 试样处理
警示：使用的所有器皿不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。
12.2.1 植物油脂
称取0.5g~2 g油样（准确至0.01 g）于25 mL的棕色容量瓶中，加入0.1 g BHT，加入10 mL流动
相超声或涡旋振荡溶解后，用流动相定容至刻度，摇匀。过孔径为0.22 μm有机系滤头于棕色进样瓶中，待进样。
12.2.2奶油、黄油
称取2 g~5 g样品（准确至0.01 g）于50 mL的离心管中，加入0.1 g BHT， 45℃水浴融化，加入5 g无水硫酸钠，涡旋1 min，混匀，加入25 mL流动相超声或涡旋振荡提取，离心，将上清液转移至浓缩瓶中，再用20 mL流动相重复提取1次，合并上清液至浓缩瓶，在旋转蒸发器或气体浓缩仪上，于45℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约2 mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹干。用流动相将浓缩瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。
12.2.3 坚果、豆类、辣椒粉等干基植物样品
称取2g~5g样品（准确至0.01g），用索氏提取仪或加速溶剂萃取仪提取其中的植物油脂，将含油脂的提取溶剂转移至250 mL蒸发瓶内，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩至干，取下蒸发瓶，用10 mL流动相将油脂转移至25 mL容量瓶中，加入0.1 g BHT，超声或涡旋振荡溶解后，用流动相定容至刻度，摇匀。过孔径为0.22 μm有机系滤头于棕色进样瓶中，待进样。
12.3色谱参考条件
色谱参考条件列出如下：
a）色谱柱：酰氨基柱（柱长150 mm，内径3.0 mm，粒径1.7 μm）或相当者；
b）柱温：30℃；
c）流动相：正己烷+[叔定基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液（20+1+0.1）]=90+10；
d）流速：0.8 mL/min；
e）荧光检测波长：激发波长294 nm，发射波长328 nm；
f）进样量：10pL。
注：可用Si 60硅胶柱（柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm）分离4种生育酚异构体，推荐流动相为正己烷与1，4-二氧六环按（95+ 5）的比例混合。
12.4标准曲线的制作
本法采用外标法定量。将维生素E标准系列工作溶液从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。
12.5 样品测定
试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。
13分析结果的表述
试样中ɑ-生育酚、β-生育酚、Y-生育酚或δ-生育酚的含量按式（2）计算：
式中：
X——试样中ɑ-生育酚、β生育酚、Y-生育酚或δ生育酚的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；
ρ——根据标准曲线计算得到的试样中ɑ-生育酚、β生育酚、Y-生育酚或δ生育酚的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——定容体积，单位为毫升（mL）；
f——换算因子（f =0.001）；
100——试样中量以每百克计算的换算系数；
m——试样的称样量，单位为克（g）。
计算结果保留三位有效数字。
注：如维生素E的测定结果要用ɑ-生育酚当量（ɑ-TE）表示，可按下式计算：维生素E（mg ɑ-TE/100 g）= ɑ-生育酚（mg/100 g）+β-生育酚（mg/100 g）×0.5+ Y-生育酚（mg/100 g）×0.1 +δ-生育酚（mg/100 g）×0.01。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15其他
当取样量为2 g，定容25 mL时，各生育酚的检出限为50μg/100 g，定量限为150μg/100g。
第三法 食品中维生素D的测定 液相色谱-串联质谱法
16原理
试样中加入维生素D2和维生素D3的同位素内标后，经氢氧化钾乙醇溶液皂化（含淀粉试样先用淀粉酶酶解）、提取、硅胶固相萃取柱净化、浓缩后，反相高效液相色谱C18柱分离，串联质谱法检测，内标法定量。
17试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682规定的一级水。
17.1试剂
17.1.1 无水乙醇（C2H5OH）：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法参见A.1。
17.1.2 抗坏血酸（C6H8O6）。
17.1.3 2，6-二叔丁基对甲酚（C15H24O）：简称BHT。
17.1.4 淀粉酶：活力单位≥100 U/mg。
17.1.5 氢氧化钾（KOH）。
17.1.6乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯。
17.1.7正己烷（n-C6H14）：色谱纯。
17.1.8 无水硫酸钠（Na2SO4）。
17.1.9 pH试纸（pH范围1~14）。
17.1.10 固相萃取柱（硅胶）：6 mL，500 mg。
17.1.11 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
17.1.12甲酸（HCOOH）：色谱纯。
17.1.13 甲酸铵（ HCOONH4）：色谱纯。
17.2试剂配制
17.2.1 氢氧化钾溶液（50 g/100 g）：50 g氢氧化钾，加入50 mL水溶解，冷却后储存于聚乙烯瓶中。
17.2.2乙酸乙酯-正己烷溶液（5+95）：量取5 mL乙酸乙酯加入到95 mL正己烷中，混匀。
17.2.3乙酸乙酯-正己烷溶液（15+85）：量取15 mL乙酸乙酯加入到85 mL正己烷中，混匀。
17.2.4 0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵溶液：称取0.315g甲酸铵，加入0.5 mL甲酸1 000 mL水溶解，超声混匀。
17.2.5 0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液：称取0.315 g甲酸铵，加入0.5 mL甲酸、1 000 mL甲醇溶解，超声混匀。
17.3标准品
17.3.1维生素D2 标准品：钙化醇（C28H44O，CAS号：50-14-6），纯度> 98% ，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
17.3.2 维生素D3标准品：胆钙化醇（C27H44O，CAS号：67-97-0），纯度>98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
17.3.3维生素D2-d3内标溶液（C28H44O-d3）：100 μg/mL。
17.3.4 维生素D3- d3内标溶液（C27H44O-d3）：100 μg/mL。
17.4标准溶液配制
17.4.1 维生素D2标准储备溶液：准确称取维生素D2标准品10.0 mg，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至100 mL，使其浓度约为100 μg/mL，转移至棕色试剂瓶中，于-20℃冰箱中密封保存，有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法见附录B）。
17.4.2 维生素D3标准储备溶液：准确称取维生素D3标准品10.0 mg，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至10mL，使其浓度约为100 μg/mL，转移至100 mL的棕色试剂瓶中，于-20℃冰箱中密封保存，有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法见附录B）。
17.4.3 维生素D2标准中间使用液：准确吸取维生素D2标准储备溶液10.00 mL，用流动相稀释并定容至100mL，浓度约为10.0μg/mL，有效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。
17.4.4 维生素D3标准中间使用液：准确吸取维生素D3标准储备溶液10.00 mL，用流动相稀释并定容至100 mL棕色容量瓶中，浓度约为10.0 μg/mL，有效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。
17.4.5 维生素D2和维生素D3混合标准使用液：准确吸取维生素D2和维生素D3标准中间使用液各10.00 mL，用流动相稀释并定容至100 mL，浓度为1.00 μg/mL。有效期1个月。
17.4.6 维生素D2-d3和维生素D3-d3内标混合溶液：分别量取100 μL浓度为100 μg/mL的维生素D2-d3和维生素D3-d3标准储备液加入10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 μg/mL混合内标。有效期1个月。
17.5标准系列溶液的配制
分别准确吸取维生素D2和D3混合标准使用液0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，各加入维生素D2-d3和维生素D3-d3内标混合溶液1.00 mL，用甲醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、 100 μg/L、150 μg/L、200 μg/L。
18 仪器和设备
注：使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。
18.1 分析天平：感量为0.1 mg。
18.2磁力搅拌器或恒温振荡水浴：带加热和控温功能。
18.3 旋转蒸发仪。
18.4 氮吹仪。
18.5 紫外分光光度计。
18.6 萃取净化振荡器。
18.7多功能涡旋振荡器。
18.8 高速冷冻离心机：转速≥6 000 r/ min。
18.9 高效液相色谱串联质谱仪：带电喷雾离子源。
19分析步骤
19.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。
19.2试样外理
注：处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。
19.2.1 皂化
19.2.1.1不含淀粉样品
称取2 g（准确至0.01 g）经均质处理的试样于50 mL具塞离心管中，加入100 L维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标溶液和0.4 g抗坏血酸，加入6 mL约40℃温水，涡旋1 min，加入12 mL乙醇，涡旋30s，再加入6mL氢氧化钾溶液，涡旋30s后放入恒温振荡器中，80℃避光恒温水浴振荡30min（如样品组织较为紧密，可每隔5 min~10 min取出涡旋0.5 min），取出放入冷水浴降温。
注：一般皂化时间为30 min，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾溶液.并适当延长皂化时间。
19.2.1.2 含淀粉样品
称取2 g（准确至0.01 g）经均质处理的试样于50 mL具塞离心管中，加入100μL维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标溶液和0.4 g淀粉酶，加入10 mL约40℃温水，放入恒温振荡器中，60℃避光恒温振荡30 min后，取出放入冷水浴降温，向冷却后的酶解液中加入0.4 g抗坏血酸、12 mL乙醇，涡旋30 s，再加入6 mL氢氧化钾溶液，涡旋30 s后放入恒温振荡器中，同19.2.1.1皂化30 min。
19.2.2 提取
向冷却后的皂化液中加入20 mL正己烷，涡旋提取3 min，6 000 r/min条件下离心3 min。转移上层清液到50 mL离心管，加入25 mL水，轻微晃动30次，在6000 r/min条件下离心3 min，取上层有机相备用。
19.2.3净化
将硅胶固相萃取柱依次用8 mL乙酸乙酯活化，8 mL正己烷平衡，取备用液全部过柱，再用6 mL乙酸乙酯-正己烷溶液（5+95）淋洗，用6mL乙酸乙酯-正己烷溶液（15+85）洗脱。洗脱液在40℃下氮气吹干，加入1.00mL甲醇，涡旋30s，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定。
19.3仪器测定条件
19.3.1 色谱参考条件
色谱参考条件列出如下：
a）C18柱（柱长100 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径1.8 μm），或相当者；
b）柱温：40℃；
c）流动相A：0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵溶液；流动相B：0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液；流动相洗脱梯度见表2；
d） 流速：0.4 mL/min；
e） 进样量：10 μL。
19.3.2
质谱参考条件
质谱参考条件列出如下：
a）电离方式：ESI+ ；
b）鞘气温度：375℃；
c）鞘气流速：12 L/min；
d）喷嘴电压：500 V；
e）雾化器压力：172 kPa；
f）毛细管电压：4 500 V；
g）干燥气温度：325℃；
h） 干燥气流速：10 L/ min；
i）多反应监测（MRM）模式。
锥孔电压和碰撞能量见表3，质谱图见C.5。
19.4标准曲线的制作
分别将维生素D2和维生素D3标准系列工作液由低浓度到高浓度依次进样，以维生素D2、维生素D3与相应同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以维生素D2、维生素D3标准系列工作液浓度为横坐标分别绘制维生素D2、维生素D3标准曲线。
19.5 样品测定
将待测样液依次进样，得到待测物与内标物的峰面积比值.根据标准曲线得到测定液中维生素D2、维生素D3的浓度。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应减少取样量重新按19.2进行处理后再进样分析。
20分析结果的表述
试样中维生素D2 、维生素D3的含量按式（3）计算：
式中：
X——试样中维生素D2（或维生素D3）的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；
ρ——根据标准曲线计算得到的试样中维生素D2（或维生素D3）的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——定容体积，单位为毫升（mL）；
f——稀释倍数；
100——试样中量以每100克计算的换算系数；
m——试样的称样量，单位为克（g）。
计算结果保留三位有效数字。
注：如试样中同时含有维生素D2和维生素D3，维生素D的测定结果以维生素D2和维生素D3含量之和计算。
21 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
22其他
当取样量为2 g时，维生素D2的检出限为1 μg/100 g，定量限为3 μg/100 g；维生素D3的检出限为0.2 μug/100 g；定量限为0.6 μg/100 g。
第四法 食品中维生素D的测定 高效液相色谱法
23原理
试样中的维生素D2或维生素D3经氢氧化钾乙醇溶液皂化（含淀粉试样先用淀粉酶酶解）、提取、净化、浓缩后，用正相高效液相色谱半制备，反相高效液相色谱C18柱色谱分离，经紫外或二极管阵列检测器检测，内标法（或外标法）定量。如测定维生素D2，可用维生素D3作内标；如测定维生素D3，可用维生素D2作内标。
24试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682规定的一级水。
24.1试剂
24.1.1无水乙醇（C2H5OH）：色谱纯，经检验不含醛类物质，检查方法见A.1。
24.1.2抗坏血酸（C6H8O6）。
24.1.3 2，6-二叔丁基对甲酚（C15H24O）：简称BHT。
24.1.4氢氧化钾（KOH）。
24.1.5正己烷（C4H10O）。
24.1.6石油醚（C5H12O2）：沸程为 30℃~60℃。
24.1.7无水硫酸钠（Na2SO4）。
24.1.8 pH试纸（pH范围1~14）。
24.1.9甲醇：色谱纯。
24.1.10淀粉酶：活力单位≥100 U/mg。
24.2试剂配制
24.2.1氢氧化钾溶液：50g氢氧化钾，加入50mL水溶解，冷却后储存于聚乙烯瓶中，临用前配制。
24.2.2正己烷-环己烷溶液（1+1）：量取8 mL异丙醇加入到992 mL正己烷中，混匀，超声脱气，备用。
24.2.3甲醇-水溶液（95+1）：量取50 mL水加入到950 mL甲醇中，混匀，超声脱气，备用。
24.3标准品
24.3.1维生素 D2标准品：钙化醇（C28H44O，CAS号：50-14-6），纯度>98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
24.3.2维生素D3标准品：胆钙化醇（C27H44O，CAS号：67-97-0） ，纯度> 98% ，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
24.4标准溶液配制
24.4.1维生素D2标准储备溶液：准确称取维生素D2标准品10.0 mg，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至100 mL，使其浓度约为100 μg/mL，转移至棕色试剂瓶中，于-20℃冰箱中密封保存，有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法参见附录B）。
24.4.2维生素D3标准储备溶液：准确称取维生素D3标准品10.0 mg，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至100 mL，使其浓度约为100 μg/mL，转移至100 mL的棕色试剂瓶中，于-20℃冰箱中密封保存，有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度（校正方法参见附录B）。
24.4.3维生素D2标准中间使用液：准确吸取维生素D2标准储备溶液10.00 mL，用流动相稀释并定容至100mL，浓度约为10.0μg/mL，有效期1个月，准确浓度按校正后的浓度折算。
24.4.4维生素D3标准中间使用液：准确吸取维生素D3标准储备溶液10.00 mL，用流动相稀释并定容至100mL的棕色容量瓶中，浓度约为10.0μg/mL，有效期3个月，准确浓度按校正后的浓度折算。
24.4.5维生素D2标准使用液：准确吸取维生素D2标准中间使用液10.00 mL，用流动相稀释并定容至100mL的棕色容量瓶中，浓度约为1.00μg/mL，准确浓度按校正后的浓度折算。
24.4.6维生素D3标准使用液：准确吸取维生素D3标准中间使用液10.00 mL，用流动相稀释并定容至100mL的棕色容量瓶中，浓度约为1.00μg/mL，准确浓度按校正后的浓度折算。
24.4.7标准系列溶液的配制：
24.4.7.1当用维生素 D2作内标测定维生素D3时，分别准确吸取维生素D3标准中间使用液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、10.00mL于100 mL棕色容量瓶中，各加入维生素D2内标溶液5.00 mL，用甲醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/ mL、0.40 μg/mL、0.60 μg/mL、1.00 μg/ mL。
24.4.7.2当用维生素D3作内标测定维生素D2时，分别准确吸取维生素D2标准中间使用液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、10.00 mL于100 mL棕色容量瓶中，各加入维生素D3内标溶液5.00 mL，用甲醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.40 μg/mL、0.60 μg/mL、1.00 μg/ mL。
25仪器和设备
注：使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。
25.1分析天平：感量为0.1 mg。
25.2磁力搅拌器：带加热、控温功能。
25.3旋转蒸发仪。
25.4氮吹仪。
25.5紫外分光光度计。
25.6萃取净化振荡器。
25.7半制备正相高效液相色谱仪：带紫外或二极管阵列检测器，进样器配500 μL定量环。
25.8反相高效液相色谱分析仪：带紫外或二极管阵列检测器，进样器配100μL定量环。
26分析步骤
26.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。
26.2试样处理
处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。如样品中只含有维生素D3，可用维生素D2做内标；如只含有维生素D2，可用维生素D3做内标；否则，用外标法定量，但需要验证回收率能满足检测要求。
26.2.1不含淀粉样品
称取5 g~10 g（准确至0.01 g）经均质处理的固体试样或50 g（准确至0.01 g）液体样品于150 mL平底烧瓶中，固体试样需加入20 mL~30 mL温水，加入1.00 mL内标使用溶液（如测定维生素D2，用维生素D3作内标；如测定维生素D3，用维生素D2作内标。），再加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT，混匀。加入30 mL无水乙醇，加入10 mL~20 mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于恒温磁力搅拌器上80℃回流皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。
注：一般皂化时间为30 min，如皂化液冷却后，液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾乙醇溶液，并适当延长皂化时间。
26.2.2含淀粉样品
称取5 g~10 g（准确至0.01 g）经均质处理的固体试样或50 g（精确至0.01 g）液体样品于150 mL平底烧瓶中，固体试样需加入约20 mL温水，加入1.00 mL内标使用溶液（如测定维生素D2，
用维生素D3作内标；如测定维生素D3，用维生素D2作内标）和1 g淀粉酶，放入60℃恒温水浴振荡30 min，向酶解液中加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT，混匀。加入30 mL无水乙醇，10 mL~20 mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于恒温磁力搅拌器上80℃回流皂化30 min，皂化后立即用冷水冷却至室温。
26.2.3提取
将皂化液用30 mL水转入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振荡萃取5 min，将下层溶液转移至另一250 mL的分液漏斗中，加入50 mL的石油醚再次萃取，合并醚层。
26.2.4洗涤
用约150 mL水洗涤醚层，约需重复3次，直至将醚层洗至中性（可用pH试纸检测下层溶液pH值），去除下层水相。
26.2.5 浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约3g）滤入250 mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中，用约15 mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器或气体浓缩仪上，于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩，待瓶中醚剩下约2 mL时，取下蒸发瓶，氮吹至干，用正己烷定容至2 mL，0.22μm有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相色谱系统半制备，净化待测液。
26.3测定条件
26.3.1维生素D待测液的净化
26.3.1.1半制备正相高效液相色谱参考条件
半制备正相高效液相色谱参考条件列出如下：
a）色谱柱：硅胶柱，柱长250 mm ，内径4.6 mm，粒径5μm，或具同等性能的色谱柱；
b） 流动相：环己烷+正己烷（1+1），并按体积分数0.8%加入异丙醇；
c） 流速：1 mL/ min；
d） 波长：264 nm；
e） 柱温：35℃±1℃；
f） 进样体积：500μL。
26.3.1.2半制备正相高效液相色谱系统适用性试验
取约1.00 mL维生素D2和D3标准中间使用液于10 mL具塞试管中，在40℃±2℃的氮吹仪上吹干。残渣用10 mL正己烷振荡溶解。取该溶液100μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D保留时间。然后将500 μL待测液注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D馏分于试管中。将试管置于40℃水浴氮气吹干.取出准确加入1.0 mL甲醇，残渣振荡溶解，即为维生素D测定液。
26.3.2反相液相色谱参考条件
反相液相色谱参考条件列出如下：
a）色谱柱：C18柱，柱长250mm ，柱内径4.6mm，粒径5μm，或具同等性能的色谱柱；
b）流动相：甲醇+水=95+5；
c）流速：1 mL/min；
d） 检测波长：264 nm；
e） 柱温：35℃±1℃；
f） 进样量：100μL。
26.4标准曲线的制作
分别将维生素D2或维生素D3标准系列工作液注入反相液相色谱仪中，得到维生素D2和维生素D3峰面积。以两者峰面积比为纵坐标，以维生素D2或维生素D3标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素D2或维生素D3标准曲线。
26.5样品测定
吸取维生素D测定液100μL注入反相液相色谱仪中，得到待测物与内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中维生素D2（或维生素D3）的浓度。
27分析结果的表述
试样中维生素D2（或维生素D3）的含量按式（4）计算：
式中：
X——试样中维生素D2（或维生素D3）的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；
ρ——根据标准曲线计算得到的试样中维生素D2（或维生素D3）的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V——正己烷定容体积，单位为毫升（mL）；
f——待测液稀释过程的稀释倍数；
100——试样中量以每100克计算的换算系数；
m——试样的称样量，单位为克（g）。
计算结果保留三位有效数字。
28 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
29其他
当取样量为10 g时，维生素D2或维生素D3的检出限为0.7 μg/100 g，定量限为2 μg/100 g。
