农业部2483号公告-6-2016 饲料中金刚烷胺和金刚乙胺的测定 液相色谱-串联质谱法

更新时间:2023-06-30      点击次数:175

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中华人民共和国国家标准

农业部2483号公告-6-2016

饲料中金刚烷胺和金刚乙胺的测定

液相色谱-串联质谱法

Determination of amantadine and rimantadine in feeds-

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

 

前言

本标准按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。

本标准由农业部畜牧业司提出。

本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76)归口。

本标准起草单位:中国农业科学院衣业质量标准与检测技术研究所。

本标准主要起草人:邱静、李丹.贾琪、范理。

 

1范围

本标准规定了饲料中金刚烷胺和金刚乙胺含量测定的液相色谱-串联质谱法。

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中金刚烷胺和金刚乙胺的测定。

本标准方法的检出限为1.0 μg/ kg,定量限为2.0 μg/ kg

 

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可(ke)少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 14699.1饲料采样

GB/T 20195动物饲料 试样的制备

 

3方法原理

试料中的金刚烷胺和金刚乙胺用酸化乙腈提取,固相萃取净化,液相色谱-串联质谱正离子模式测定,同位素内标法定量。

 

4试剂与材料

除另有说明,所有试剂均为分析纯和符合GB/T 6682 中规定的一级水。试验中所用制剂按GB/ T 603的规定制备。

4.1 甲醇:色谱纯。

4.2 乙腈:色谱纯。

4.3冰乙酸。

4.4 甲酸:色谱纯。

4.5 盐酸。

4.6 氨水。

4.7 1%乙酸乙腈溶液:取冰乙酸(4.310 mL,用乙腈(4.2)溶解并稀释至1 000 mL

4.8 0.1%甲酸水溶液:取1 000mL水,加入1 mL甲酸(4. 4)。

4.9 2%盐酸水溶液:取2mL盐酸(4.5),用水溶解并稀释至100mL

4.10 5%氨水甲醇溶液:取5mL氨水(4.6),用甲醇(4.1)溶解并稀释至100mL

4.11 50%乙腈水溶液:取50 mL乙腈(4.2),用水溶解并稀释至100 mL

4.12金刚烷胺标准品:含量≥98.0%

4.13 D15-金刚烷胺标准品:含量≥99.0%

4. 14金刚乙胺标准品:含量≥98.0%

4.15 D4-金刚乙胺标准品:含量≥99.0%

4.16金刚烷胺、D15-金刚烷胺、金刚乙胺、D4-金刚乙胺标准储备溶液:分别称取10.00mg金刚烷胺(4. 12)、D15-金刚烷胺(4.13)、金刚乙胺(4.14)和D4-金刚乙胺(4.15)标准品于10 mL容量瓶中,用甲醇(4.1)溶解并稀释至刻度,分别配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液。-20℃以下保存,有效期为3个月。

4.17金刚烷胺和金刚乙胺混合标准工作溶液:分别量取1.0mg/ml的金刚烷胺、金刚乙胺标准储备溶液(4.16)适量,于100mL容量瓶中用甲醇(4.1)稀释至刻度.配制成金刚烷胺、金刚乙胺浓度为10.0μg/ mL的混合标准工作溶液。2~8℃保存,有效期为14d

4.18 D15-金刚烷胺和D4-金刚乙胺混合内标工作溶液:分别量取1.0 mg/ mlD15-金刚烷胺和D4-金刚乙胺标准储备溶液(4.16)适量,于100 mL容量瓶中用甲醇(4.1)稀释至刻度,配制成D15-金刚烷胺和D4-金刚乙胺浓度为1.0 μg/ mL的混合内标工作溶液。2~8℃保存,有效期为14d

 

5仪器和设备

5.1 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI)。

5.2天平:感量0.01g

5.3分析天平:感量0.01mg

5.4 振荡器。

5.5涡旋混合器。

5.6固相萃取仪。

5.7高速离心机:转速210000 r/ mil

5.8氮吹仪。

5.9固相萃取柱:混合型阳离子交换固相萃取柱60 mg3 mL,或性能相当者。

5. 10微孔滤膜:0. 2μm有机系。

 

6采样和试样制备

采样按照GR/T 14699.1的规定抽取有代表性的样品,四分法缩减取样。按GB/T 20195的规定制备试样,将饲料样品磨碎。通过0.45mm空筛,混匀,装入密闭容器中,避光低温保有备用。

 

7分析步骤

7.1 提取

准确称取2g(精确至0.01g)试样至50mL离心管中,加入20μL 1.0μg/mL的混合内标工作溶液(4.18),然后加入10 mL 1%乙酸乙腈溶液(4.7),涡旋1min,于振荡器中室温振荡30 min10 000 r/min离心10 min,上清液转移至50 mL离心管中,残渣用10 mL 1%乙酸乙腈溶液(4.7)涡旋2 min10 000r/min离心10 min,上清液合并至50 mL离心管中,待净化[若样品中目标物浓度过高,可从提取液中分取1 mL~2mL,用1%乙酸乙腈溶液(4.7)定容至10mL,混匀后待净化]

7.2 净化

混合阳离子固相萃取柱先用3mL甲醇(4.1)活化,3mL水平衡,然后将上清液上柱,流速控制在2/s~3/s,依次用3 mL 2%盐酸水溶液(4.9 3 mL甲醇(4.1)淋洗,抽干3 min,用5 mI 5%氨水甲醇(4.10)洗脱,收集洗脱液于15 mL离心管中,50℃条件下氮气吹干,1.00 mL 50%乙腈水溶液(4. 11)复溶,涡旋30s后过0.22 μm滤膜到样品瓶中,上机测定。

7.3标准曲线绘制

准确量取适量金刚烷胺和金刚乙胺混合标准工作溶液(4.17)、D15-金刚烷胺和D4-金刚乙胺混合内标工作溶液(4.18),用50%乙腈水溶液(4.11)稀释配制成金刚烷胺和金刚乙胺浓度为2.00 μg/L4.00 μg/ L20.0 μg/L100.0 μg/L200.0 μg/L1 000.0 μg/ LD15-金刚烷胺和D4-金刚乙胺浓度均为20.0μg/L的系列标准工作溶液,供液相色谱-串联质谱测定。分别以金刚烷胺和D15-金刚烷胺、金刚乙胺和D4-金刚乙胺的定量离子质量色谱峰面积之比为纵坐标,对应的标准溶液浓度比为横坐标,绘制标准曲线,求回归方程和相关系数。

7.4 测定

7.4. 1液相色谱参考条件

色谱柱:C18柱长150 mm内径2.1 mm粒径3.5 μm;或性能相当者。

流动相:A0.1%甲酸水溶液(4.8),B为甲醇(4.1)。

流速:0.30 mL/min

进样量:10 μL

流动相梯度洗脱程序见表1

                                              image.png

7.4.2质谱参考条件

离子源:电喷雾离子源。

扫描方式:正离子扫描

检测方式:多反应离子监测(MRM)。

脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体。

喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最(zui)优灵敏度。

监测离子参数情况见表2

image.png

7.4.3 定性测定

在相同试验条件下,待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差在±2.5%之内,并且色谱图中各组分定性离子对的相对丰度,与浓度接近标准工作液中相应定性离子对的相对丰度进行比较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判断为样品中存在对应的待测物。

image.png

7.4.4 定量测定

取试样溶液和标准溶液上机测定,以色谱峰保留时间和离子对定性,分别以金刚烷胺和D15-金刚烷胺金刚乙胺和D4-金刚乙胺的色谱峰面积比做单点或标准曲线校准,用内标法定量。试样溶液中目标物与内标的峰面积比均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下,金刚烷胺和金刚乙胺标准溶液特征离子的质量色谱图参见附录A。按以上步骤对同一试样进行平行测定。

 

8结果计算

试样中金刚烷胺或金刚乙胺的含量X,以质量分数表示,单位为微克每千克(μg/ kg ,按式(1)或式(2)计算。

单点校准:

image.png

或标准曲线校准:

image.png

式中:

Ci——由标准曲线得出的试样溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺浓度,单位为微克每升

(μg/L);

Cis——试样溶液中相应的D15-金刚烷胺或D4-金刚乙胺浓度,单位为微克每升(μg/L);

Cs——标准溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺浓度,单位为微克每升(μg/L);

C’is——标准溶液中相应的D15 -金刚烷胺或D4-金刚乙胺浓度,单位为微克每升(μg/L);

Ai——试样溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺峰面积;

Ais——试样溶液中相应的D15-金刚烷胺或D4-金刚乙胺峰面积;

As——标准溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺峰面积;

A'is——标准溶液中相应的D15-金刚烷胺或D4 -金刚乙胺峰面积;

V——残余物定容体积,单位为毫升(mL);

m——供试试样的质量,单位为克(g);

ρ——提取液稀释倍数;

1 000——换算系数。

测定结果用平行测定的算术平均值表示,计算结果保留3位有效数字。

 

9重复性

在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%


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