中华人民共和国国家标准
GB 31656.13-2021
食品安全国家标准
水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定
液相色谱-串联质谱法
National food safety standard-
Determination of nitrofuran metabolites residues in aquatic products
by liquid chromatography-tandem mass spectrometry method
1范围
本文件规定了水产品中硝基呋喃类代谢物3-氨基-2-噁唑烷基酮(3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)、5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮(5-morpholinomethyl-3-amino-2- oxazolidinone，AMOZ)、1-氨基-2-内酰脲(1-aminohydantoin，AHD)和氨基脲(semicarbazide，SEM)残留量的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于鱼、海参及鳖等水产品可食组织中硝基呋喃类代谢物AOZ、AMOZ、AHD和SEM残留量的测定，以及虾和蟹等甲壳类可食组织中AOZ、AMOZ和AHD的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可（ke）少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 30891-2014水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4.原理
试料中残留的硝基呋喃类蛋白结合态代谢物在酸性条件下水解，经2-硝基苯甲醛衍生化，用乙酸乙酯液液萃取，高速离心净化，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1 甲醇(CH3OH)：色谱纯。
5.1.2乙酸铵(CH3COONH4)色谱纯。
5.1.3 乙酸乙酯(C4H8O2)：色谱纯。
5.1.4 二甲亚砜[(CH3)2SO]：色谱纯。
5.1.5 2-硝基苯甲醛(C7H5NO3)：色谱纯。
5. 1.6 无水磷酸氢二钾(K2HPO4)。
5.1.7 盐酸(HCI)。
5.2溶液配制
5.2.1 0.5 mol/L盐酸溶液：取盐酸42 mL，用水稀释至1 000 mL，混匀。
5.2.2 0.002 mol/L乙酸铵溶液：取乙酸铵0.15 g，用水溶解并稀释至1 000 mL，混匀。
5.2.3 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：取2-硝基苯甲醛0.076 g，用二甲亚砜溶解并稀释至10 mL，混匀，现用现配。
5.2.4 1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液：取无水磷酸氢二钾87.1 g，用水溶解并稀释至500 mL，混匀。
5.2.5 5%甲醇溶液：取甲醇5 mL，用水稀释至100 mL，混匀。
5.3标准品
5.3. 1硝基呋喃类代谢物： AOZ、AMOZ、AHD、HCI和SEM·HCI，含量均≥99.0%，具体内容见附录A。
5.3.2 内标：AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCI-13C，15N2，含量均≥99.0%，具体内容见附录A。
5.4 标准溶液配制
5.4.1标准储备液：取AOZ、AMOZ、AHD、HCI、SEM·HCI标准品各适量(相当于活性成分10 mg)，精密称定，加甲醇适量使溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，配制成浓度为1.0 mg/mL标准储备液。
-18℃避光保存，有效期6个月。
5.4.2混合标准中间液：分别准确量取标准储备液适量，用甲醇逐级稀释，配制成浓度为1.0μg/mL混合标准中间液。2℃~8℃避光保存，有效期1个月。
5.4.3混合标准工作液：分别准确量取混合标准中间液各1mL于10mL和100mL棕色容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为100 μg/L和10 μg/L混合标准工作液。现用现配。
5.4.4同位素内标标准储备液：取AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCI-13C，15N2标准品各适量(相当于活性成分10mg)，精密称定，加甲醇适量使溶解并稀释定容至10mL棕色容量瓶，配制成浓度为1.0 mg/mL内标标准储备液。-18℃避光保存，有效期6个月。
5.4.5混合内标标准工作液：分别准确量取同位素内标标准储备液适量，用甲醇逐级稀释，配制成浓度为100 μg/L混合内标标准工作液。-18℃避光保存，有效期3个月。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离源。
6.2 分析天平：感量0.01 g和0.00001 g。
6.3离心机：6000 r/ min.
6.4高速离心机：14000 r/min。
6.5 涡旋混合器。
6.6恒温振荡器。
6.7氮吹仪。
7试料的制备与保存
7.1试料的制备
按GB/T 30891-2014附录B的要求制样。
a)取均质的供试料品，作为供试试料；
b)取均质的空白样品，作为空白试料；
c)取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。
7.2 试料的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1水解与衍生化
取试料2g(精确至±0.01g)，于50mL聚丙烯离心管中，准确加入混合内标标准工作液50μL，涡旋混合1 min，加盐酸溶液5 mL、2-硝基苯甲醛溶液0. 15 mL，涡旋混合1 min，置于恒温振荡器中，37℃避光振荡16 h。
8.2 提取净化
取出离心管冷却至室温，用磷酸氢二钾溶液调pH至7.0~7.5，加乙酸乙酯8 mL，涡旋振荡30 s，6 000 r/min离心5 min，取上清液至10 mL玻璃离心管，40℃氮气吹干。加5%甲醇溶液1.0 mL溶解残留物，再将溶液转移至1.5 mL离心管中，以14 000 r/min的转速离心10 min，取清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱分析。
8.3标准曲线的制备
分别准确移取10 μg/L和100 μg/L混合标准工作液各0.05 mL、0.1 mL、0.2 ml于6个50 mL离心管中，除不加试料外，按7.1和7.2步骤操作，使最终浓度分别为0.5 μg/L、1.0 ug/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、20 μg/L，按7.4测定。以测得特征离子质量色谱峰外标和内标峰面积比值为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
a)色谱柱：C18 色谱柱(100 mm×2. 1 mm，3.5 μm)，或相当者。
b)柱温：35℃ ；
c)进样量：10μL；
d)流速：0.35 mL/min；
e)流动相：A为0.002 mol/L乙酸铵溶液，B为甲醇。梯度洗脱条件见表1。
8. 4.2 质谱参考条件
a)离子源：电喷雾离子源；
b)扫描方式：正离子扫描；
c)检测方式：多反应离子监测( MRM)；
d)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体；
e)喷雾电压.碰撞能等参数应优化至最（zui）优灵敏度；
f)监测离子参数情况见表2。
8.5 测定法
8.5.1定性测定
在同样测试条件下，试料溶液中硝基呋喃类代谢物的保留时间与标准溶液中硝基呋喃类代谢物的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3的要求。
8.5.2 定量测定
取试料溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量，按内标法计算，标准溶液及试料溶液中的硝基呋喃类代谢物响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述液相色谱-质谱条件下，硝基呋喃类代谢物标准溶液的液相色谱-质谱图见附录B。
8.6 空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试料中硝基呋喃类代谢物的残留量按标准曲线法或公式(1)计算。
式中：
X——试料中硝基呋喃类代谢物的残留量的数值，单位为微克每千克(μg/kg)；
Cis——试料溶液中硝基呋喃类代谢物内标浓度的数值，单位为微克每升(μg/L)；
Cs——对照溶液中硝基呋喃类代谢物浓度的数值，单位为微克每升(μg/L)；
C'is——对照溶液中硝基呋喃类代谢物内标浓度的数值，单位为微克每升(μg/L)；
Ai——试料溶液中硝基呋喃类代谢物的峰面积；
Ais——试料溶液中硝基呋喃类代谢物内标的峰面积；
As——对照溶液中硝基呋喃类代谢物的峰面积；
A'is——对照溶液中硝基呋喃类代谢物内标的峰面积；
V——定容体积的数值，单位为毫升(mL)；
n——试料质量的数值，单位为克(g)。
10检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10.1 灵敏度
本方法AOZ、SEM、AMOZ、AHD的检测限均为0.5μg/kg，定量限均为1.0 μg/kg。
10.2准确度
本方法在1.0 μg/kg~10 μg/kg添加浓度水平上的回收率为70%~120%。
10.3 精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
