中华人民共和国农业行业标准
NY/T 3949-2021
植物源性食品中酚酸类化合物的测定
高效液相色谱-串联质谱法
Determination of phenolic acids in foods of plant origin by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
1范围
本文件规定了植物源性食品中酚酸类化合物的高效液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于果蔬及其制品、谷物、茶叶、药食同源等植物源性食品中阿魏酸、对羟基苯甲酸、对-香豆酸、丁香酸、龙胆酸、芥子酸、咖啡酸、没食子酸、水杨酸、香草酸、异阿魏酸、原儿茶酸、2-羟基肉桂酸、2,3-二羟基苯甲酸、2,3,4-三羟基苯甲酸、3-羟基肉桂酸含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可（ke）少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义
4原理
试样经碱性水解液提取处理后水解为游离酚酸类化合物，采用高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
5试剂与材料
5.1 试剂
5.1.1 水：GB/T 6682规定的一级水
5. 1.2氢氧化钠(NaOH)：优级纯。
5.1.3 盐酸(HCl)：优级纯。
5.1.4 乙酸乙酯(CH3COOCH2CH3)：优级纯
5. 1.5乙腈(CH3CN)：色谱纯。
5.1.6甲醇(CH3OH)：色谱纯。
5.1.7 抗坏血酸(C6H8O6)：优级纯。
5.1.8 乙二胺四乙酸(C10H16N2O8)：优级纯。
5.2试剂配制
5.2.1 氢氧化钠溶液(3 mol/L，含1%抗坏血酸和0.3%乙二胺四乙酸)：称取120 g氢氧化钠(5.1.2)、10 g抗坏血酸(5.1.7)、3.0g乙二胺四乙酸(5.1.8)，加入700 mL水中，待溶解后转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
5.2.2盐酸溶液(6 mol/L)：量取50 mL，盐酸(5.1.3)，缓慢注入50 mL蒸馏水中，混匀。
5.2.3 70%甲醇水溶液：取70 ml.甲醇(5.1. 6)和30 mL水，混匀。
5.3 标准品
16种酚酸类化合物标准品：纯度≥98.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。相关信息见附录A。
5.4标准溶液的配制
5.4.1标准储备溶液(1mg/mL)：分别准确称取16种酚酸标准品各10mg(精确至0.01mg)，用甲醇(5.1.6)溶解于10 mL容量瓶，并定容至刻度，于-18℃下储存于密闭棕色玻璃瓶中，有效期为6个月。
5.4.2标准中间溶液：分别吸取0.2mL标准储备溶液于25mL棕色容量瓶中，用70%甲醇水溶液(5.2.3)定容至25mL，制成标准中间溶液，现用现配。
5.4.3标准工作溶液：吸取适量标准中间溶液，用70%甲醇水溶液(5.2.3)配制成质量浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL 的标准曲线工作溶液，现用现配。
5.5材料
有机相微孔滤膜：孔径为0.22μm。
6仪器设备
6.1高效液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源(ESI- )。
6.2 天平：感量0.01 mg，0.1 mg。
6.3匀浆机。
6.4高速粉碎机。
6.5离心机：转速≥8000 r/min。
6.6旋转蒸发仪：带有温度控制。
6.7涡旋振荡器。
6.8涡旋混合器。
7试样制备
试样取可食部进行制备。果汁、酒类等均匀的液体试样直接混匀；带悬浮物的液体试样、新鲜果蔬、半固体等试样经匀浆机匀浆；固体试样采用高速粉碎机粉碎。试样制备后储存于样品瓶中备用，所有制备试样于-18℃条件下保存。
8分析步骤
8.1 提取
称取试样1 g~5 g(精确至0.000 1 g)于50 mL离心管中，加入30 mL 3 mol/L氢氧化钠溶液(5.2.1)，用涡旋振荡器混匀，振荡提取60 min，用6 mol/L盐酸溶液(5.2.2)调节pH至1.5~2.0，经离心机8000r/min离心10min，上清液移入分液漏斗，分别用70mL乙酸乙酯(5.1.4)萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，于35℃~40℃下旋转蒸发至干，加入5 mL 70%甲醇水溶液(5.2.3) ，溶解蒸干后的物质，过滤膜(5.5)，待测。
8.2测定
8.2.1仪器参考条件
a)色谱柱：HSS T3色谱柱，柱长100 mm，内径2.1 mm，颗粒度1.7μm，或性能相当者；
b)流动相：A为乙腈(5.1.5)，B为水溶液(5.1.1)；
c)进样量：10μL；
d)柱温：30℃；
e)梯度洗脱程序，见表 1；
f)扫描方式： 离子源为电喷雾电离源负离子扫描方式(ESI-)；
g)去溶剂气和锥孔反吹气流速分别为800 L/h和150 L/h，气体均为高纯氮气；
h)碰撞气流速为0.15 mL/min，气体为氩气；
i)去溶剂辅助加热温度为400℃；
j)离子源温度为150℃。
k)监测离子对、碰撞气能量和源内破碎电压见附录B。
8.2.2标准工作曲线
标准工作溶液注入液相色谱质谱仪按照8.2.1条件进行测定，以各酚酸类化合物质量浓度为横坐标、响应的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
8.2.3定性测定
在相同试验条件下，试样济液中各酚酸类化合物的保留时间与标准工作溶液中各酚酸类化合物的保留时间的偏差在±2.5%以内；且试样溶液中各酚酸类化合物的定性离子的相对非度，与浓度接近的标准工作溶液中各酚酸类化命物的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定试样溶液中存在被测化合物。16 种酚酸类化合物的多反应监测色谱图见附录C。
表2 质谱选择离子丰度允许偏差
单位为百分号
相对丰度 | ＞50 | 20~50 | 10~20 | ≤10 |
允许偏差 | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
8.2.4定量测定
试样中各酚酸类化合物采用外标法定量，保证所测试样中组分的响应值的的标准工作曲线的线性范围内。
8.3分析结果的表述
试样中酚酸类化合物的含量以质量分数表示，单位为毫克每千克，按公式（1）计算。
式中：
ω——试样中酚酸类化合物的含量的数值，单位为毫克每千克(mg/kg)；
ρ——从标准曲线上得到的被测组分溶液质量浓度的数值，单位为微克每毫升(μg/mL)；
f——试样溶液稀释倍数；
V——试样溶液的定容体积的数值，单位为毫升(mL)；
m——试样质量的数值，单位为克(g)。
以2次测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
9精密度
9.1 重复性
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的15%。
9.2 再现性
在再现性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
10 其他
本文件方法丁香酸、香草酸、2,3,4-三羟基苯甲酸和芥子酸的检出限均为0.2 mg/kg，定量限均为0.5 mg/kg；龙胆酸、对羟基苯甲酸、3-羟基肉桂酸、2羟基肉桂酸和咖啡酸的检出限均为0.1 mg/kg，定量限均为0.3mg/kg；原儿茶酸、没食子酸、对香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、水杨酸、2,3-二羟基苯甲酸的检出限均为0.03 mg/kg，定量限均为0.1 mg/kg。
