中华人民共和国农业行业标准
NY/T 3513-2019
生乳中硫氰酸根的测定 离子色谱法
Determination of thiocyanate in raw milk-lon chromatography
1范围
本标准规定了生乳中硫氰酸根测定的离子色谱法。
本标准适用于牛、羊、水牛、牦牛等不同奶畜（chu）生乳中硫氰酸根的测定。
本标准的检出限为0.25 mg/kg，定量限为0.75 mg/kg。
2规范性引用文件
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GB/T 6682分析实验室用水规格盒试验方法
3原理
试样用乙腈沉淀蛋白，上清液加水调节并经反相固相萃取柱净化后，用离于色谱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。
4试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
4.1水，GB/T 6682，一级。
4.2乙腈(CH3CN)色谱纯。
4.3甲醇(CH3OH)：色谱纯。
4.4丙酮(C3H6O)：色谱纯。
4.5 50%氢氧化钠溶液(NaOH)：色谱纯
4.6离子色谱淋洗液：根据仪器型号及色谱注选择和配制不同的淋洗液体系。
4.6. 1氢氧根系淋洗液由仪器自动在线生成或手工配制。
4.6.1. 1氢氧化钾淋洗液：由淋洗液自动电解发生器在线生成，浓度为45 mmol /I ~60 mmol/L。
4.6.1.2氢氧化钠淋洗液(45 mmol/L)：取2.34ml 50%氢氧化钠溶液(4.5)，用水稀释至1 000 mL，可通入氮气保护，以减缓碱性淋洗液吸收空气中的CO2而失效，缓慢播匀，室温下可放置7 d。
4.6.1.3氢氧化钠淋洗液(60 mmol/L) ：取3.12 mL 50%氢氧化钠溶液(4.5) ，用水稀释至1000 mL，可通入氮气保护。以减缓碱性淋洗液吸收空气中的CO2而失效，缓慢摇习，室温下可放置7 d。
4.6.2碳酸盐系淋洗液(Na2CO3浓度为5 mmol/L，NaHCO3浓度为2 mmol/L，丙酮浓度为5%)：准确称取0.5300g碳酸钠和0.1680g碳酸氢钠，分别溶于适量水中，转移至1000mL容量瓶，加入50mL丙酮，用水稀释定容，混匀。
4.7硫酸溶液(45 mmol/L) ：移取2.45 mL浓硫酸，加入适量水中，并用水定容至1 000 mL，混匀。
4.8硫氰酸根标准储备溶液(1 000 mg/L) ：将硫氰酸钠(NaSCN， CAS号； 540-72-7 ，纯度≥99.99%)于80℃烘箱内烘干2 h。准确称取干燥后的硫氰酸钠0.139 7 g，用水定容至100 mL，混匀。0℃~4℃保存，有效期为6个月。
4.9硫氰酸根标准中间溶液(10 mg/L)：准确吸取1 mL硫氰酸根标准储备液(4.8)，用水稀释至100mL，混匀。0℃~4℃保存，有效期为1个月。
4.10硫氰酸根标准系列溶液：分别准确移取硫氰酸根标准中间溶液(4.9)0 μL、10μL、20 μL、50μL、100μL、500μL和1 000μL用水定容至10 mL，混匀，得到浓度分别为0 mg/ L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.05mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L和1.00 mg/L的硫氰酸根标准工作液。0℃~4℃保存，有效期为1个月。
5仪器设备
5.1离子色谱仪：配抑制器电导检测器。
5.2高速冷冻离心机：8 000 r/ min，4℃。
5.3天平：感量为0.1 mg、0.01 g。
5.4涡旋混匀器。
5.5移液器：100μL、1 mL。
5.6烘箱：（80±5）℃。
5.7过滤器：水系，0.22 μm。
5.8反相净化小柱，如OnGuard II RP柱(1.0 mL)，或性能相当者。
6样品
采集的有代表性生乳样品可用硬质玻璃瓶成聚乙烯瓶盛放，样品采集后应尽快分析。著样品在0℃~6℃冷藏保存，冷藏时间不应超过48 h；若不能及时测定，应于-20℃冷冻保存，冷冻时间不应超过30 d，解冻温度不应超过60℃，解冻次数不应超过5次。冷藏、冷冻的样品需恢复至室温并摇匀，待测。
7试验步骤
7.1试样处理
称取试样4 g(精确至0. 01 g)，用乙腈定容至10 mL，混匀1 min，静置20 min，离心5 min。准确移取1.00 mL上清液用水定容至10 mL并混匀，备用。同时做空白试验。
7.2 提取液净化
将反相净化小柱依次用5 mL甲醇和10 mL水活化，静置30 min，取上述溶液(7.1)，过0.22μm滤膜并加载到活化好的净化反相柱上，弃去前3 mL流出液，收集滤液，待测。
7.3仪器参考条件
7.3.1仪器参考条件
7.3.1.1色谱柱：以OH-为流动相，并能使用梯度洗脱的、高容量的阴离子交换柱，如IonPac AS-16型色谱柱(4 mm×250 mm)和IonPac AG-16型保护柱(4 mm×50 mm)，或性能相当的离子色谱柱。
7.3.1.2抑制器：ASRS-300 4mm阴离子抑制器，或性能相当的抑制器；外加水抑制模式，抑制器电流为112 mA~ 149 mA，外加水流量1.2 mL/min。
7.3.1.3淋洗液：氢氧根系淋洗液(4.6.1)，流速为1.0 mL/ min，梯度淋洗。梯度淋洗条件参见表1。
7.3.1.4进样体积：100 μL。
7.3. 1.5 柱温： 30℃。
7.3.1.6电导池温度 ：35℃。
7.3.2仪器参考条件
7.3.2.1色谱柱：碳酸盐淋洗体系的高容量阴离子交换柱，如Metrosep Anion Supp5-150(4 mm×150 mm)阴离子交换色谱柱和Metrosep Anion Guard(4 mm×50 mm)专用保护柱) ，或性能相当的离子色谱柱。
7. 3.2.2抑制器：MSM II型抑制器，抑制器再生液为硫酸溶液(4.7)。
7.3. 2.3淋洗液：碳酸盐系淋洗液(4.6. 2)，流速为1.0 mL/min。
7.3.2.4进样体积：100μL。
7.3. 2.5 柱温： 30.0℃。
7.3.2.6 电导池温度：40.0℃。
7.4标准系列溶液和试样溶液分析
按选定的仪器参考条件Ⅰ或Ⅱ，对硫氰酸根标准系列溶液和试样溶液进行测定。不同淋洗液体系的标准溶液色谱图参见附录A。
7.5 定性
以硫氰酸根的保留时间定性，试样溶液中硫氰酸根的保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中硫氰酸根的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。
7.6 定量
以硫氰酸根的浓度为横坐标、色谱峰面积(或峰高)为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试样溶液用水溶液稀释n倍后，重新测定。
8试验数据处理
试样中硫氰酸根的含量以质量浓度ω计，数值以毫克每千克(mg/kg)表示，按式(1)计算。
式中：
c——待测溶液从标准曲线上查得硫氰酸根的质量浓度，单位为毫克每升(mg/L)； .
V1——样品用乙腈提取时定容体积，单位为毫升(mL) ；
V2——移取离心后 上清液的体积，单位为毫升(mL)；
V3——上清液稀释定容的体积，单位为毫升(mL)；
m——试样质量，单位为克(g)；
n——上机测定的试样溶液超出规定的范围后，进一步稀释的倍数。
计算结果保留至小数点后2位，用2次平行测定的算术平均值表示。
注：试样中测得的硫氰酸根离子含量乘以换算系数1.40，即得硫氰酸钠含量。
9精密度
在重复性条件下，2次独立测试结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的10%。
