中华人民共和国农业行业标准
NY/T 3945-2021
植物源性食品中游离态甾醇、结合态甾醇及总甾醇的测定
气相色谱串联质谱法
Determination of free， bound and total sterols in foods of plant origin
by gas chromatography-mass spectrometry
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020（标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出。
本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口。
本文件起草单位：浙江大学、农业农村部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（杭州）。
本文件主要起草人：陆柏益、王蒙蒙、胡银洲、杨博文、钟永恒、徐涛。
1范围
本文件规定了植物源性食品中游离态甾醇、结合态甾醇及总甾醇的测定方法。
本文件适用于植物源性食品中甾醇类化合物含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而网成不这件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
植物源性食品foodg of plant origin
以植物的种子、果实或组织部分为原料，直接或加工以后为人类提供能量或物质来源的食品。
3.2
游离态甾醇free sterol
以游离状态存在的甾醇
3.3
结合态甾醇bound sterol
以结合态存在的甾醇。
3. 4
总甾醇total sterol
以游离态和结合态有在的留醇的总和。
4原理
非食用油类样品采用索氏抽提法提取油脂，油脂通过固相萃取分离得到游离态甾醇：油脂用氢氧化钾-乙醇溶液皂化后，以二氯甲烷进行液液萃取分离得到总甾醇。以胆甾烷醇为内标，经气相色谱分离、质谱检测，得到总甾醇和游离态甾醇含量，两者相减得到结合态甾醇含量。
5试剂和材料
5.1试剂
5.1.1 正己烷（C6H14，CAS号：110-54-3）：色谱纯。
5.1.2正己烷（C6H14，CAS 号：110-54-3）。
5.1.3石油醚（C5H12，CAS号：8032-32-4）：30℃~60℃沸程。
5.1.4 乙醚（C4H10O，CAS号：60-29-7）。
5.1.5 乙醇（C2H6O，CAS号：64-17-5）。
5.1.6丙酮（CH3COCH3，CAS 号：67-64-1）：色谱纯。
5.1.7二氯甲烷（CH2Cl2 ，CAS号：75-09-2）。
5.1.8 无水硫酸钠（Na2SO4，CAS号：7757-82-6）。
5.1.9氢氧化钾（KOH，CAS 号：1310-58-3）。
5.1.10 N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺（C8H12F7NOSi，CAS号：53296-64-3）。
5.1.11 1-甲基咪唑（C4H6N2，CAS号：616-47-7）。
5.1.12乙醚-正己烷溶液（10：90，V：V）：量取乙醚（5.1.4）10 mL，加入正己烷（5.1.2）90 mL，混匀，现用现配。
5.1. 13 乙醚-正己烷溶液（20：80，V：V）：量取乙醚（5.1.4）20 mL，加入正己烷（5.1.2）80 mL，混匀，现用现配。
5.1.14氢氧化钾乙醇溶液（2 mol/L）：称取氢氧化钾（5.1.9）11.2 g（精确至1 mg）， 10 mL水溶解，用乙醇（5.1.5）定容至100 mL，现用现配。
5.1.15硅烷化试剂：称取N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺（5.1.10）950μL，加入1-甲基咪唑（5.1.11）50 μL，现用现配。
5.2 标准品
5.2. 1胆固醇（Cholesterol，CAS 号：57-88-5），纯度≥99%。
5.2.2胆甾烷醇（Cholestanol，CAS号：80-97-7），纯度≥95%。
5.2.3菜籽甾醇（Brassicasterol，CAS号：474-67-9），纯度≥95%。
5.2.4菜油甾醇（Campesterol，CAS号：474-62-4） ，纯度≥95%。
5.2.5菜油甾烷醇（Campestanol，CAS号：474-60-2），纯度≥95%。
5.2.6豆甾醇（Stigmasterol，CAS号：83-48- 7），纯度≥95%。
5.2.7 β-谷甾醇（β-Sitosterol，CAS号：83-46-5），纯度≥95%。
5.2.8豆甾烷醇（Stigmastanol，CAS号：83- 45-4） ，纯度≥95%。
5.2.9麦角甾醇（Ergosterol，CAS号：57-87-4），纯度≥95%。
5.2.10标准混合储备溶液（1000μg/mL） ：准确称取一定量的胆固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麦角甾醇和菜油甾烷醇标准品（精确至0.1mg），用丙酮（5.1.6）分别配制为1mg/mL的单标溶液。精确量取上述8种标准溶液各1 mL，用氮气缓缓吹干溶剂，再用1 mL丙酮（5.1.6）复溶，配制成浓度1 mg/mL的标准混合储备溶液。-18℃以下避光保存，保存期为3个月。
5.2.11标准中间工作液（ 100 μg/ ml） ：移取标准混合储备溶液（5.2.10），以丙酮（5.1.6）为溶剂，配制成100 μg/mL的标准中间工作液，现用现配。
5.2.12内标溶液：准确称取胆角烷醇标准品，以丙酮（5.1.6）为溶剂，配制成浓度为200μg/mL的内标溶液。
5.3 材料
5.3.1固相萃取柱：无键合硅胶填料固相萃取柱（500 mg/6 mL），或其他等效柱。
5.3.2反应瓶：容量1 mL，具螺纹瓶盖和聚四氟乙烯（PTFE）线纹封口。
6仪器和设备
6.1气相色谱串联质谱仪：配电子轰击电离源。
6.2 分析天平：感量0.1 g、0.01 g和0.1 mg。
6.3涡旋振荡器。
6.4离心机： 转速≥5000 r/min。
6.5组织捣碎机。
6.6固相萃取设备：要求能够控制活化、上样、淋洗和洗脱的速度。
6.7 超声波清洗器：功率≥500 w.
6.8索氏抽提器。
6.9 氮气吹干仪：要求能够控制温度，30℃~100℃。
6.10 恒温箱：0℃~150℃。
6.11恒温水浴摇床：要求能够控制温度和转速，30℃~99.9℃，0 r/min~200 r/min。
7样品制备
取谷类、油料作物、坚果等样品约100g，粉碎后充分混匀，放入密封袋中。取新鲜的蔬菜和水果可食部约200 g，将其切碎，充分混匀，放入组织捣碎机中捣碎成匀浆，放入聚乙烯瓶中。植物油等搅拌均匀，放入聚乙烯瓶中。
8试验步骤
8.1油脂提取
8.1. 1 试样处理
a）固体试样：称取充分混匀后的试样5 g~10 g，精确至0.01 g，全部移入滤纸简内。
b）液体或半固体试样：植物油类样品直接按照8.2操作。其他液体或半固体试样混匀后，称取50 g~100 g，精确至0.1 g，置于蒸发皿中，加入石英砂约20 g，于沸水浴上蒸干后，在电热鼓风干燥箱中于（100±5）℃干燥30 min~ 60 min后，取出，研细，全部移入滤纸筒内。蒸发皿及粘有试样的玻璃棒，均用沾有乙醚的脱脂棉擦净，并将棉花放入滤纸筒内。
8.1.2 提取
将滤纸筒放入索氏抽提器的抽提筒内，连接干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶内容积的2/3处，于水浴上加热，使石油醚不断回流抽提（6次/h~8次/h），一般抽提6 h~10h。提取结束时，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上无油斑表明提取完毕。
8.1.3 称量
取下接收瓶，回收石油醚，待接收瓶中溶剂剩余1 mL~2 mL时在水浴上蒸干，再于（100±5）℃干燥1 h，放入干燥器内冷却0.5 h后称量。重复以上操作直至恒重（直至2次称量的差不超过2 mg）。
8.2 甾醇的提取与净化
8.2.1游离态甾醇的提取与净化
定量称取油样提取液（8.1）50 mg（精确至0.1 mg）于离心管中，加入内标溶液（5.2.12）100 μL后用正己烷（5.1.2）5 mL溶解，涡旋振荡均匀。称取无水硫酸钠（5.1.8）1.0 g加到固相萃取柱（5.3.1）的上方，用正己烷（5.1.2）10 mL活化，流速1 mL/min， 弃去流出液：将备用液5 mL全部过柱，流速1 mL/min，弃去流出液：用乙醚-正己烷溶液（5.1.12）10 mI淋洗，流速1 mL/min，弃去流出液：用乙醚-正己烷溶液（5.1.13）10 mL洗脱，流速1 mL/min，洗脱液收集于离心管中，40℃~50℃水浴条件下氮吹，剩余约1mL停止，转移到反应瓶（5.3.2）中备用。
8.2.2总甾醇的提取与净化
定量称取油样提取液（8.1）50 mg（精确至0.1 mg）于离心管中，加入内标溶液（5.2.12）100 μL，再加入氢氧化钾乙醇溶液（5.1.14）4 mL、二氯甲烷（5.1.7）0.5 mL，涡旋混匀后，（25±5）℃摇床水浴18 h，转速（40±5） r/min。加入二氯甲烷（5.1.7）5 mL、水3 mL，轻轻混匀，3 000 r/ min离心5 min，除去上层水相，有机相分别用水5mL洗涤3次，至下层溶液澄清。将所得有机相于40℃~50℃水浴条件下氮吹，剩余约1 mL时停止，转移到反应瓶（5.3.2）中备用。
8.3甾醇三甲基硅醚的制备
在40℃条件下氮气缓缓吹干反应瓶（8.2.1或8.2.2）中的溶剂，再加入硅烷化试剂（5.1.15）100 μL，旋紧反应瓶盖，放于75℃的恒温箱中反应20 min，冷却至室温，加入正己烷（5.1.1）复溶至1 mL，供气相色谱串联质谱仪检测。
8.4 测定
8.4.1气相色谱参考条件
a）载气：氦气（纯度99.999%）：
b）色谱柱：DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）或等效柱：
c）进样口温度为290℃：进样方式为不分流进样：进样量为1 μL：流速为1.2 mL/min：
d）程序升温：初始温度100℃（保持1 min），以50℃/min升至220℃，以5℃/min升至290℃
（保持15 min）。
8.4.2质谱参考条件
a）电离能量：70 eV：
b）电离方式：EI：
c）离子源温度：250℃：
d）传输线温度：2900：
e）监测方式：SIM模式：
f）检测离子对见附录B。
8.4.3定性测定
用气相色谱串联质谱仪测定衍生完毕的试样（8.3）记录总离子流图和质谱图。在相同实验条件下，通过标准品的保留时间和对应质谱图进定性。
8.4.4 定量测定
8.4.4.1甾醇相对响应因子的测定
准确量取标准中间工作液（5.2.11）适量，用丙酮逐级稀释成含各甾醇浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的系列混合工作液，从中各取1 mL到反应瓶（5.3.2）中，加入内标溶液（5.2.12）100μL，按照8.3衍生后，测定胆固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麦角甾醇和菜油甾烷醇三甲基硅醚的峰面积。结合内际物的已知含量，分别计算胆固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、麦角甾醇和菜油甾烷醇三甲基硅醚与胆甾烷醇三甲基硅醚（内标）的相对响应因子（具体见9.2），以3次测定的平均值表示，用于后续定量。
8.4.4.2样品溶液的测定
用气相色谱串联质谱仪测定衍生后的试样（8.3），分别测定各甾醇三甲基硅醚在规定提取离子条件下的峰面积，独立平行测足3次，不同甾醇三甲基硅醚的定量离子组合见附录A，不听甾醇三甲基硅醚的色谱图参见附录B。
9结果表示
9.1试样中油脂含量的计算
试样中油脂含量按公式（1）计算，
式中：
ϕ——试样中油脂的含量的数值，单位为毫克每克（mg/g）：
m0——接收瓶质量的数值，单位为克（g）：
m1——恒重后接收瓶和脂肪的质量的数值，单位为克（g）：
m——试样的质量的数值，单位为克（g）：
1 000——换算系数。
9.2相对响应因子的计算
甾醇相对响应因子按公式（2）计算。
式中：
Fi——甾醇与胆甾烷醇三甲基硅醚（内标）的相对响应因子的数值，其中F1、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9分别代表标准溶液中的胆固醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的相对响应因子：
Ai，s——内标或甾醇峰面积的数值，其中A0，s、A1，s、A3，s 、A4，s、A5，s、A6，s、A7，s、A8，s、A9，s分别代表标准溶液中的胆甾烷醇（内标）、胆固醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的峰面积：
Ci，s——标准溶液中甾醇的含量的数值，其中C0，s、C1，s、C3，s 、C4，s、C5，s、C6，s、C7，s、C8，s、C9，s分别代表标准溶液中的胆甾烷醇（内标）、胆固醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇和豆甾烷醇三甲基硅醚的含量的数值，单位为微克每毫升（μg/mL）。
9.3试样中甾醇的计算
采用内标法对试样中游离态甾醇和总甾醇进行定量分析，各甾醇含量按公式（3）计算。
式中：
Ci——试样中各游离甾醇或总甾醇含量的数值，单位为毫克每千克（mg/kg）：
M0——内标胆甾烷醇质量的数值，为0.02mg：
m——称取油脂质量的数值，单位为毫克（mg）：
Ai——试样中各甾醇三甲基醚峰面积的数值：
A0——-试样中胆甾烷醇三甲基醚峰面积的数值：
ϕ——油脂含量的数值，单位为毫克每克（mg/g）：
1 000——换算系数。
结合态甾醇含量为C结合=C总- C游离。
计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，植物油和固体试样结果保留小数点后1位，其他液体和半固体样品结果保留小数点后2位。
10 精密度
10.1 重复性
在重复性条件下获得的2次独立的测试结果的绝对差值不大于这2个测定值的算术平均值的20%。
10.2再现性
在再现性条件下获得的2次独立的测试结果的绝对差值不大于这2个测定值的算术平均值的20%。
11 其他
本方法植物油中各甾醇检出限为2 mg/ kg，定量限为10 mg/kg：谷类中各甾醇检出限为0.02 mg/kg，定量限为0.1mg/kg：油料作物、坚果中各甾醇检出限为1mg/kg，定量限为5mg/kg：蔬菜和水果中各甾醇检出限为0.002 mg/kg，定量限为0.01 mg/kg。
