中华人民共和国国家标准
农业农村部公告第628号-13-2022
转基因生物及其产品食用安全检测
抗营养因子 大豆中凝集素检测方法 液相色谱-串联质谱法
Food safety detection of genetically modified organisms and derived
products-Determination of anti-nutrient soybean agglutinin in soybean
by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。
本文件起草单位：农业农村部科技发展中心、中国农业大学、谱尼测试集团股份有限公司。
本文件主要起草人：黄昆仑、梁晋刚、车会莲、张旭冬、杨柏崇、王军、韩诗雯、贺晓云、马丽艳、许文涛、罗云波。
1范围
本文件规定了大豆中凝集素的液相色谱-串联质谱检测方法。
本文件适用于转基因大豆及其产品中大豆凝集素含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可的的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验宝用水规格和试验方法。
3术语和定义
本文件没有需要界定的水语和定义
4原理
试样经研磨粉碎过筛后，提取蛋白质，定量、还原烷基化、酶解后，利用反相高效液相色谱进行多肽分离，质谱仪进行检测，保留时间与质谱进行定性，质谱外标法定量。
5试剂和材料
除另有规定外，仅使用分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1甲酸（CH2O2，CAS号：64-18-6）：色谱纯
5.2乙腈（CH3CN，CAS号：75-05-8）：色谱纯。
5.3丙酮（C3H6O，CAS 号67-64-1）：色谱纯。
5.4 SDS溶液（4%）：称取0.4g SDS，溶解在10 mL水中。
5.5 牛血清白蛋白（BSA）。
5.6 BSA工作试剂：取50份标准工作液A与1份标准丰作液B混合均匀。
5.6.1标准工作液A：分别称取10g BSA、20 g碳酸钠（Na2CO3·2H20）、1.6g酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）、4 g氢氧化钠（NaOH）、9.5 g碳酸氢钠（NaHCO3），溶解在1L水中，用氢氧化钠溶液或固体碳酸氢钠调节pH至11.25。
5.6.2 标准工作液B：称取2 g五水硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶解在50 mL水中。
5.7二硫苏糖醇溶液（1 mol/L）：称取0.16 g二硫苏糖醇，溶解在1 mL水中，现用现配。
5.8碘乙酰胺溶液（500 mmol/L）：称取0.093 g碘乙酰胺，溶解在1 mL水中。
5.9碳酸氢铵溶液（50 mmol/L）：称取0.04 g碳酸氢铵，溶解在10 mL水中。
5.10胰蛋白酶（称取0.01g胰蛋白酶，溶解到1mL冰上预冷20min以上的50mmol/L碳酸氢铵中，使用前配制）。
5.11 流动相。
A液：0.1%甲酸，2%乙腈。
B液：0.1%甲酸， 80%乙腈。
5.12标准多肽标准曲线
分别配制0.05μg/μL、1μg/μL、5μg/μL、10μg/μL、20μg/μL合成的定性定量多肽（ALYSTPIH1-WDK）和定性定量复合多肽（NSWDPPNPHIGINVNSIR）标准品溶液，并绘制曲线。
6仪器和设备
6.1 分析天平：感量0.000 1 g、0.001 g和0.01 g。
6.2 1.5 mI离心管。
6.3研磨振荡器。
6.4恒温水浴锅/金属干浴。
6.5多功能酶标仪。
6.6 60目不锈钢筛。
6.7离心机：转速不低于 24 000 g。
6.8 C18固相萃取膜片（C18固相萃取小柱）。
6.9液相色谮串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。
6.10冻干仪。
6.11高速粉碎机。
6.12高速研磨提取仪。
7试样制备
取干净样品质量大于500 g，采用对角线分割法，取对角部分缩减至200 g，将其粉碎通过60目不锈钢筛。加封后标识明确，一份做试样，一份做留样。充分混匀，装瓶，密封，避光备用。
8测定步骤
8.1 蛋白质样品提取
准确称取1.00g（精确至0.1g）检测试样，加入8000μL 4%SDS溶液，加入锆珠，研磨振荡10min后，95℃水浴10min，置于研磨振荡器中振荡10min。24200g、4℃下离心10min，取上清液200μL用于LC-MS/MS定量，另取100 μL上清液用于蛋白质浓度定量。
8.2蛋白质提取液定量（BCA法）
制备一组蛋白质标准品：配制浓度为0μg/μL、0.125μg/μL、0.250μg/μL、0.500μg/μL、0.750μg/μL、1.000μg/μL、1.500μg/μL的牛血清白蛋白标准品溶液。取25μL标准品及待测样品于微孔板中， 每孔中加入200μL BSA工作试剂。在微孔板振荡器上混合30 s后，于37℃孵育30 min。冷却至室温后，在多功能酶标仪上测量562nm处的吸光度。以标准品浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制线性标准曲线图，再依据测定的吸光值计算大豆样品中蛋白质浓度。
8.3蛋白质还原烷基化与沉淀
加入2μL 1mol/L二硫苏糖醇溶液储备液至200μL蛋白质提取液中，55℃恒温水浴锅中反应40 min；加20μL 500 mmol/L碘乙酰胺溶液，避光反应30 min；用900μL 20℃预冷的丙酮沉淀，置于-20℃过夜，24 200 g离心20 min，小心吸取并弃去上清液；用800μL 80%丙酮洗涤沉淀，-20℃静置30 min，24 200 g离心，小心吸取并弃去上清液；再用800μL 80%预冷丙酮洗涤沉淀；小心吸取并弃去上清液，通风橱中静置15 min；待丙酮挥发，用150μL 50 mmol/L NH3HCO3重悬蛋白质，以8.2所测得蛋白质浓度乘样品体积计算出蛋白质总量，按照1：50的酶和蛋白质质量比例加入胰蛋白酶进行酶解。用醋酸或者氨水调节pH至8左右，补足体积至190μL，置于37℃恒温水浴锅中进行酶解反应过夜。酶解后的溶液样品，加10μL 10%甲酸溶液，置于4℃冰箱静置30 min，24 200 g离心30 min后，吸取150） μL，置于液相进样小瓶中待测。
8.4 测定
8.4.1色谱条件
a）色谱柱：C18色谱柱（4.6 mm×50mm，3.5μm，130A），或性能相当者；
b）柱温：50℃；
c）流动相：流动相A：0. 1%甲酸，水；流动相B：0.1%甲酸，80%乙腈；
d）流速：200μL/min；
e）进样体积：10μL；
f）梯度洗脱程序见表1。
8.4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）电离方式：正离子模式；
c）检测方式：平行离子扫描（PRM） ； .
d）喷雾电压碰撞能量、离子源温度等参数优化至最优灵敏度；
e）脱溶剂气、碰撞气为高纯氮气或者其他合适气体；
f）定性定量离子设定见表2。
8.4.3定性定量方法
8.4.3.1定性测定
利用标准肽一和标准肽二的保留时间和二级谱图（或者子离子）进行定性。其中标准肽一作为本标准的定性与定量分子，标准肽二作为本标准的定性与定量复核分子。
样品与标准品保留时间的相对偏差不大于0.5%。样品的3个特征离子基峰百分数与标准品允许差分别为：当基峰百分数>50%时，允许差±20%；当基峰百分数20%~50%时，允许差±25%；当基峰百分数10%~20%时，允许差±30%；当基峰百分数≤10%时，允许差±50%。
8.4.3.2 定量测定
用标准肽一的离子对（ 652.3/888.5）峰面积进行标准曲线外标法定量（记为X μg/μL）。
9结果的计算与表述
试样中大豆凝集索含量按公式（1）计算。
R——大豆凝集素含量的数值，以质量分数计，单位为克每千克（g/kg）；
X——从标准曲线上得到的被测组分溶液质量浓度的数值，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
m——试样质量的数值，单位为千克（kg）。
注1：大豆凝集素的分子量为30 927.99；
注2：多肽的分子量为1 303.47；
注3：大豆提取后的体积为0.8 mL。
10精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
11其他
本方法大豆中凝集素的检出限为2pg/kg，定量限为6pg/kg。
