中华人民共和国国家标准
GB/T 42956-2023
饲料中泰乐菌素、泰万菌素、替米考星的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of tylosin， tylvalosin and tilmicosin in feeds-
Liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）提出并归口。
本文件起草单位：四川省饲料工作总站、四川省中安检测有限公司、新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所。
本文件主要起草人：程传民、李云、许艳丽、王宇萍、达列亚、冯波、蒋福霖、程大顺、赵立军、张静、柏雪、宋彦琪、叶绿、樊淑娜、邝婷婷、徐定慧、陈飞、何利梅、夏子晴。
1范围
本文件描述了饲料中泰乐菌素、泰万菌素和替米考星的液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中泰乐菌素、泰万菌素和替米考星的测定。
本文件的方法检出限为0.02mg/kg，定量限为0.05mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 20195动物饲料 试样的制备
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中的待测物用乙腈溶液提取，经混合型阳离子交换柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。
5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
5.1 水：GB/T 6682，一级。
5.2 乙腈：色谱纯。
5.3甲酸：色谱纯。
5.4 50%乙腈溶液：取500 mL乙腈，加水稀释至1 000 mL，混匀。
5.5 0.1%甲酸溶液：取1 mL甲酸（5.3），加水稀释至1 000 mL，混匀。
5.6 磷酸二氢钾溶液（0.1 mol/L）：称取磷酸二氢钾13.61 g，加水溶解并稀释至1 000 ml，混匀。
5.7 5%氨化甲醇：取氨水5 mL，加甲醇稀释至100 mL，混匀。
5.8 标准贮备溶液（1 mg/mL）：称取泰乐菌素A（CAS号：1401-69-0，含量≥98.0%）、泰万菌素（CAS号：63409-12-1，含量≥97.0%）、替米考星标准品（CAS号：108050-54-0，含量≥94.0%）各10 mg（精确至0.01 mg），用甲醇溶解，分别转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀。-18℃以下保存，有效期3个月。
注：如所用标准品为相应的盐，折算成有效成分。
5.9混合标准中间溶液（10μg/mL）：准确移取标准贮备溶液（5.8）各1mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容，混匀。-18℃以下保存，有效期3个月。
5.10 内标贮备溶液（0.5mg/mL）：称取替米考星-d3（CAS号：108050-54-0，含量≥98.0%）5 mg（精确至0.01 mg），用甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀。-18℃以下保存，有效期3个月。
5.11内标工作溶液（5μg/mL）：准确移取1mL内标贮备溶液（5.10）于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀。-18℃以下保存，有效期3个月。
5.12混合标准系列溶液：准确移取适量混合标准中间溶液（5.9）和内标工作溶液（5.11）于容量瓶中，用5%氨化甲醇（5.7）稀释定容，配制成质量浓度分别为0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL和内标质量浓度均为5 ng/mL的混合标准系列溶液。临用现配。
5.13 混合型阳离子交换固相萃取柱：60 mg/3 mL，或性能相当者。
5.14 微孔滤膜：0.22μm，有机系。
6仪器设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2 分析天平：精度为0.1 mg和0.01 mg。
6.3旋涡混合器。
6.4振荡器。
6.5 离心机：转速不低于7 000 r/min。
6.6 固相萃取装置。
7样品
按GB/T 20195制备试样。取样品至少200g，粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛，充分混匀，装入密闭容器中，备用。
8试验步骤
8.1 提取
平行做两份试验。称取试样2 g（精确至0.1 mg）于50 mL离心管中，准确加入内标工作溶液（5.11）100 μL.50%乙腈溶液（5.4）10 mL，300 r/min振荡提取15 min，7 000 r/min离心5 min，移取上清液至另一50 mL离心管。残渣用50%乙腈溶液（5.4）10 mL重复提取一次，合并两次上清液，混匀。准确移取混合上清液1 mL，加人磷酸二氢钾溶液（5.6）5 mL，混匀，备用。
8.2 净化
混合型阳离子交换固相萃取柱（5.13）依次用甲醇3 mL、水3 mL和磷酸二氢钾溶液（5.6）3 mL活化。取全部备用液（8.1）过柱，流速小于2 mL/min。依次用磷酸二氢钾溶液（5.6）和水各3 mL淋洗，抽干。准确移取5%氨化甲醇（5.7）5mL.洗脱，收集洗脱液，混匀，用微孔滤膜（5.14）过滤，作为试样溶液，待测。
8.3 测定
8.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C18色谱柱，柱长50 mm，内径2.1 mm，粒径1.8μm，或性能相当者；
b）柱温：35℃；
c）进样量：5μL；
d）流动相：A相为乙腈，B相为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序见表1。
8.3.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+ ）；
b）检测方式：多反应监测（MRM）；
c）毛细管电压：3.5 kV；
d）离子源温度：350℃；
e）干燥气流速：7 L/min；
f）雾化气压力：35 psi（241 kPa）；
g）化合物多反应监测（MRM）离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。
8.3.3混合标准系列溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液（5.12）和试样溶液（8.2）上机测定。多反应监测（MRM）色谱图见附录A。
8.3.4 定性
在相同试验条件下，试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中待测物的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中待测物监测离子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的监测离子对的相对离子丰度，若最大允许偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
8.3.5 定量
按照8.3.1和8.3.2设定仪器条件，取试样溶液和混合标准系列溶液上机分析，以标准溶液浓度为横坐标，以待测物与内标的色谱峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，作单点或多点校准。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应重新试验。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。
9试验数据处理
试样中泰乐菌素A、泰万菌素和替米考星的含量以质量分数ωi计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示。多点校准按公式（1）计算，单点校准按公式（2）计算：
式中：
ρi——由标准曲线查得试样溶液中待测物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；
V2——固相萃取时洗脱液的体积，单位为毫升（mL）；
n——上机测定的试样溶液超出线性范围后，进一步稀释的倍数；
V1——净化时所用试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；
m——试样的质量，单位为克（g）。
式中：
Ai——试样溶液中待测物的峰面积；
A'is——标准溶液中内标的峰面积；
Cs——标准溶液中待测物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
Cis——试样溶液中内标的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；
V2——固相萃取时洗脱液的体积，单位为毫升（mL）；
n——上机测定的试样溶液超出线性范围后，进一步稀释的倍数；
Ais——试样溶液中内标的峰面积；
As——标准溶液中待测物的峰面积；
C'is——标准溶液中内标的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——净化时所用试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；
m——试样的质量，单位为克（g）。
结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
10 精密度
在重复性条件下，两次独立测试结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的20%。
