中华人民共和国轻工行业标准
QB/T 5716-2022
食品中低聚木糖的测定 高效液相色谱法
Determination of xylo-oligosaccharide in food- High performance liquid
chromatography method
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由中国轻工业联合会提出。
本文件由全国食品工业标准化技术委员会（SAC/TC64） 归口。
本文件起草单位：山东龙力生物科技股份有限公司、安徽省食品药品检验研究院、中国生物发酵产业协会、国贸食品科技（北京）有限公司（国家副食品质量监督检验中心）、广东龙和生物科技有限公司、河南益常青生物科技有限公司、武汉远大弘元股份有限公司、天津科技大学。
本文件主要起草人：张居舟、李建军、肖林、何国亮、程坚、苏小冰、刘二停、王晋、何俊、张文文、刘阳、李静、张成林。
本文件为首次发布。
1范围
本文件描述了食品中低聚木糖的高效液相色谱测定方法。
本文件适用于食品中低聚木糖的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 35545低聚木糖
3术语和定义
GB/T 35545界定的术语和定义适用于本文件。
4方法提要
根据样品中的低聚木糖及其配料组成，可选用“乙醇沉淀去除多糖、胶体，乙酸锌和亚铁氰化钾沉淀去除蛋白质，石油醚分离移除脂质"中的一种或多种结合的方法提取样品中的低聚木糖，提取液经硫酸溶液水解成木糖，使用高效液相色谱仪分别测定样品水解前后木糖的含量，水解后与水解前木糖含量的差值乘以低聚木糖和木糖的平均转化系数，即得样品中低聚木糖的含量，外标法定量。
5试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1 试剂
5.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.2无水乙醇（C2H5OH）。
5.1.3 硫酸（H2SO4）：优级纯。
5.1.4 氢氧化钠（NaOH）。
5.1.5氨水或三乙胺（NH4OH或C6H15N）。
5.1.6 石油醚（沸程：30℃~60℃）。
5.1.7乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]。
5.1.8 亚铁氰化钾{K4[Fe（CN）6]·3H2O}。
5.1.9冰乙酸（CH3COOH）。
5.2试剂配制
5.2.1 4.0 mol/L硫酸溶液：取55 mL硫酸（5.1.3），缓缓加到150 mL水中，边加边搅拌，并用水稀释至250 mL，配制成4.0 mol/L硫酸溶液。
5.2.2氢氧化钠溶液：称取20.0g氢氧化钠（5.1.4），加水溶解并稀释至100 mL。
5.2.3乙酸锌溶液：称取乙酸锌（5.1.7）21.9g，加冰乙酸（5.1.9）3 mL，加水溶解并稀释至100 mL。
5.2.4亚铁氰化钾溶液：称取亚铁氰化钾（5.1.8）10.6g， 加水溶解并稀释至100 mL。
5.3标准品
木糖标准品（C5H10O5，CAS：58-86-6），纯度不小于99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.4标准溶液配制
5.4.1木糖标准储备液（5.0 mg/mL）：准确称取0.125g（精确至0.1 mg）木糖标准品于25 mL容量瓶中，用水溶解并进行定容，混合均匀，于-18℃下保存，有效期6个月。
5. 4.2木糖标准工作液：准确量取5.0 mg/mL木糖标准储备液（5.4.1）适量，用水稀释，配制成浓度为0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、5.0 mg/mL的系列标准工作液，现配现用。
5.5 材料
0.45μm滤膜：水系。
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪：配示差折光检测器。
6.2 电子天平：感量0.1 mg和0.001 g。
6.3 涡旋振荡器。
6.4 氮吹仪（可控温）。
6.5 pH计或广泛pH试纸。
6.6 离心机：转速不低于8000 r/min。
6.7恒温水浴锅。
6.8 超声清洗器。
6.9 其他实验室常见仪器。
7试样制备
7.1液体样品
将液体样品摇匀分装，密封冷藏。
7.2 半固态样品
将蜂蜜、蜜膏等取可食部分搅匀分装，密封冷藏
7.3 固态样品
固体样品制成均匀的粉状，可直接分装，常温密封保存。
8分析步骤
8.1水解前样品的处理
8.1.1液体样品
准确量取5 mL试样置50 mL容量瓶，加10 mL水，涡旋混匀，缓慢逐滴加入无水乙醇，并不断摇动，直至刻度，混匀，离心（8000r/min， 5min），取上清液25.0 mL，于沸水浴挥去乙醇（或70℃氮吹浓缩除去乙醇），加水复溶，并转移至25 mL容量瓶中定容。若溶液浑浊，离心（8000 r/min， 5 min），上清液作为水解前试样溶液，经0.45μm滤膜过滤后，供高效液相色谱仪分析。
8.1.2固态、半固态样品
称取试样1g~5g（精确至0.001g） （低聚木糖含量不大于5%时，称取5g；低聚木糖含量大于5%且小于20%时，称取2.5g；低聚本糖含量不小于20%时，称取1g）于50mL比色管中，加15 mL水溶解，涡旋混匀后超声30 min，再用无水乙醇定容至刻度，混匀，离心（8 000 r/min， 5min） ，取上清液25.0mL，于沸水浴挥去乙醇（或70℃氮吹浓缩除去乙醇），加水复溶，并转移至25 mL容量瓶中定容。若溶液浑浊，离心（8 000r/min， 5 min），上清液作为水解前试样溶液，经0.45μm滤膜过滤后，供高效液相色谱仪分析。
8.1.3乳及乳制品等高蛋白样品（包含奶粉、液态奶、奶制品、蛋白粉、豆奶粉、蛋白饮料等）称取试样1g~5g （精确至0.01g）（低聚本糖含量不大于5%时，称取5 g；低聚木糖含量大于5%且小于20%时，称取2.5 g；低聚木糖含量不小于20%时，称取1g）于50mL比色管中，加约15 mL水溶解，涡旋混匀后超声30 min （液体乳样品取5 mL于50 mL离心管中，加5 mL水，涡旋混匀），缓慢加入乙酸锌溶液（5.2.3）2.5 mL，摇匀，再加入亚铁氰化钾溶液（5.2.4）2.5mL，摇匀，再用无水乙醇定容至刻度，混匀，离心（8 00r/min，5 min），取上清液25.0mL，于沸水浴挥去乙醇（或70℃氮吹浓缩除去乙醇），加水复溶，并转移至25 mL容量瓶中定容。若溶液浑浊，离心（8 00o r/min，5 min），上清液作为水解前试样溶液，经0.45μm滤膜过滤后，供高效液相色谱仪分析。
8.1.4脂肪含量大于10%的样品
称取试样1g~5g （精确至0.001g）（低聚木糖含量不大于5%时，称取5g；低聚木糖含量大于5%且小于20%时，称取2.5 g；低聚木糖含量不小于20%时，称取1g）于50 mL离心管中，加入10 mL石油醚，涡旋2min，离心（8 000 r/min，5min） ，弃去石油醚后，重复以上步骤至去除大部分脂肪，70℃水浴氮气下除去残存石油醚，加水15 mL溶解，涡旋后超声30 min，再加无水乙醇定容至50 mL，混匀，离心（8 000 r/min，5 min），取上清液25.0 mL，于沸水浴挥去乙醇（或70℃氮吹浓缩除去乙醇），加水复溶，并转移至25 mL容量瓶中定容。若溶液浑浊，离心（8 000 r/min，5 min），上清液作为水解前试样溶液，经0.45μm滤膜过滤后，供高效液相色谱仪分析。
若出现既属于脂肪含量大于10%的样品，又属于高蛋白的样品，按8.1.4 处理。
8.2水解后样品的处理
8.2.1水解
准确量取水解前试样溶液10.00mL加入4.0 mol/L硫酸溶液（5.2.1）1.8mL，摇匀，100℃水浴下水解90 min后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（5.2.2）调pH至5~7，用无水乙醇定容至50 mL，静置或离心（8 000 r/min，5min），取上清液（2.0k）mL，于70℃下氮吹至近干，用水定容至2.0 mL，经0.45μm滤膜过滤后，供高效液相色谱仪测定。
根据样品中低聚木糖含量确定浓缩倍率k值（k=0.5、1、2、3、4、5），使样品水解后溶液木糖浓度在标准曲线范围内。
8.3标准曲线的制作
将配制的标准工作溶液，按浓度由低到高的顺序经液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标作图，绘制标准曲线。
8.4测定
8.4.1液相色谱参考条件1
氨基色谱柱参考条件：
a）色谱柱：氨基色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm），或具有同等性能的色谱柱：
b）流动相：乙腈+水=75+25（体积比）；
c）流速：1.0 mL/min；
d柱温：35℃；
e）示差检测器温度：35℃；
f）进样体积：20μL。
8.4.2液相色谱参考条件2
酰胺基色谱柱参考条件：
a）色谱柱：酰胺基色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm），或具有同等性能的酰氨基色谱柱；
b）流动相：乙腈+水+三乙胺（或氨水）=750+250+1（体积比）；
c）流速：1.0 mL/min；
d）柱温：35℃；
e）示差检测器温度：35℃；
f）进样体积：20μL。
8.5样品测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，测得相应的峰面积，由标准曲线得到试样溶液中木糖的浓度。在上述色谱条件下，标准溶液和试样溶液的高效液相色谱图见附录A。
8.6空白试验
除不加试样外，采用完全相同的步骤进行操作。
9分析结果的表述
试样中低聚木糖的含量按公式（1） （2） （3） （4）计算：
式中：
X1——样品水解前木糖含量，单位为克每百克或克每百毫升（g/100g或g/100mL）；
c1——水解前样品溶液中木糖的浓度，单位为亳克每毫升（mg/mL）；
V1——水解前样品溶液的总稀释体积，单位为毫升（mL）；
m——样品的质量或体积，单位为克或毫升（g或mL）；
X2——样品水解后木糖含量，单位为克每百克或克每百毫升（g/100g或g/100mL）；
c2——水解后样品溶液中木糖的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
V2——水解后样品溶液的总稀释体积，单位为毫升（mL）；
k——水解后样品溶液浓缩倍率；
Xxos——样品中低聚木糖的含量，单位为克每百克或克每百毫升（g/100g或g/100mL）；
1 000——换算系数；
1.1——低聚木糖和木糖的平均校正因子。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留3位有效数字。
10 灵敏度
当取样量为5 mL时，低聚木糖检出限为0.1 g/100mL。
当称样量为5g时，低聚木糖检出限为0.1 g/100g。
11 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。
