中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4364-2023
畜禽固体粪污中139种药物残留的测定 液相色谱-高分辨质谱法
Determination of 139 drug residues in faeces of livestock and poultry solid manure-Liquid chromatography-high resolution mass pectrometry
1范围
本文件描述了畜禽固体粪污中139种药物残留的液相色谱-高分辨质谱测定方法。
本文件适用于畜禽固体粪污中139种药物残留的定性。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 25169畜禽粪便监测技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
畜禽固体粪污livestock and poultry solid manure
畜禽养殖过程中产生的粪、尿、外漏饮水和冲洗水及少量散落饲料等组成的固态混物。
注：一般指干物质（DM）含量≥15%的畜禽粪污。
4原理
畜禽固体粪污中的药物残留用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液和乙腈提取，经QuEChERS方法净化，用液相色谱高分辨质谱仪定性.基质匹配标准溶液校准，外标法定量。
5试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂。
5.1 水：GB/T 6682一级水。
5.2 甲醇：色谱纯。
5.3 乙腈：色谱纯。
5.4 50%甲醇溶液：取10 mL甲醇，用水溶解并稀释至20 mL。
5.5流动相A：称取0.15g乙酸铵.置于1000mL容量瓶中，用水溶解，再加2mL甲酸，并用水定容，混匀。
5.6流动相B：准确量取2 mL甲酸，用甲醇稀释至1 000 mL。
5.7 Na2EDTA-Mellvaine缓冲液：分别称取无水磷酸氢二钠10.9 g，乙二胺四乙酸二钠3 g，柠檬酸12.9 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。
5.8混合标准储备溶液（100μg/mL）：分别精密称取标准品适量，并用其指出的溶剂配制成8组混合标准储备溶液（见附录A）。其中，A组（20种）、B组（15种）、C组（8种）、D组（8种）、E组（2种）、F组（5种）、G组（2种）、H组（13种）。A组、B组、C组、D组、G组、H组6组标准储备溶液置于-20℃以下避光保存，有效期为12个月；其他2组标准储备溶液置于-20℃以下避光保存，有效期为2个月。或购买商品化有证标准储备溶液。
5.9 混合标准中间溶液（1μg/mL）：准确量取各组混合标准储备溶液（5.8）100μL，用50%甲醇溶液（5.4）稀释，混匀。临用现配。
5.10混合标准系列工作溶液：准确量取混合标准中间溶液（5.9）适量，置于10mL容量瓶中，用50%甲醇溶液（5.4）稀释成2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ngmL、50 ng/mL、100 ngmL混合标准系列工作溶液，混匀。临用现配。
5.11 QuEChERS盐析包：每份含4 g硫酸钠及1 g氯化钠。
5.12 QuEChERS除脂分散净化剂：每份含1g净化剂或性能相当的产品。
6仪器设备
6.1液相色谱高分辨质谱仪：配有电喷雾离子源的飞行时间质谱。
6.2 分析天平：精度为0.01 mg和0.01 g。
6.3涡旋混合仪。
6.4离心机：转速不低于9 500 r/min。
6.5氮吹仪。
6.6冷冻干燥机。
6.7 微孔滤膜：0.22μm，有机系。
7样品
7.1 试样制备
采样地点及采样量按照GB/T 25169畜禽粪便监测技术规范进行（不做加酸处理）。所采集的畜禽固体粪污样品采用冷冻干燥至恒重（2次称重值之差≤10 mg），经研磨过2 mm分析筛，再细磨过0.25 mm分析筛制成制备样。常温干燥避光保存。
7.2 基质空白试样
选取混合程度较高、待测物保留时间处仪器响应值应小于定量限对应响应值的30%的畜禽固体粪污作为基质空白样品。
8试验步骤
8.1 提取
平行做2份试验。准确称取试样2 g（精确到0.01 g），置于50 mL离心管中，加入8 mL Na2EDTA-Mclvaine缓冲液（5.7），涡旋混匀，再加入10.0 mL乙腈（V），涡旋1 min 后加入1份萃取盐包（5.11），静置10min使盐析分层，9500r/min条件下离心10min，准确量取8mL的上层清液（V2）于15mL离心管中，在40℃下，氮气吹干，用2 mL乙腈复溶，备用。
8.2 净化
称取0.5g除脂分散净化剂（5.12）于15 mL净化管，加入2 mL水，混匀，涡旋2 min后，将上述2 mL备用复溶液（8.1）全部转移至净化管中得到4 mL净化溶液（V3），涡旋1 min，在9 500 r/min条件下离心5min，上清液过滤膜，供液相色谱-高分辨质谱仪分析测定。
8.3基质匹配混合标准系列溶液的制备
取若干份空白试样，按“8.1"和“8.2"处理，制备空白试样溶液，准备量取混合标准系列工作溶液（5.10）各1 mL，氮气吹干后，用空白试样溶液1 mL稀释，混匀。供液相色谱高分辨质谱仪测定。
8.4 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C18柱，柱长150 mm，内径3.0 mm，粒径1.8 μm，或性能相当者；
b）柱温：40℃；
c）流速：0.4 ml/min；
d）进样量：2μL；
e）梯度洗脱程序见表1。
8.5 质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子模式（ESI+）；
c）碎裂电压：125 V；
d）干燥气温度：250℃；
e）雾化气压力：241.315 kPa；
f）毛细管电压：3 000 V；
g）采集模式：全扫描（Scan MS）及二级离子扫描（Target MS/MS）；
h）Scan MS模式监控窗口：相对质量偏差≤10×10-6（10ppm），扫描范围：50m/z~1300m/z；
i）Target MS/MS模式监控窗口：相对质量偏差≤15×10-6 （15ppm），扫描范围：50m/z~1000 m/z；
j）采集频率：2 spectra/s。
8.6 高分辨质谱谱库构建
输入139种药物的中英文名称.CAS号及化学式，由高分辨质谱谱库构建软件计算得到每个标准品的理论质量数。采用100ng/mL的混合标准工作溶液在全扫描（Scan MS）模式下进行测定，得到每个药物的保留时间和母离子精确质量数测定值；在二级离子扫描（TargetMS/MS）模式下，对每种药物进行碎片离子谱图采集，并将其导入高分辨质谱谱库，与相应药物的保留时间（见附录B）、精确质量数测定值、中英文名称、CAS号、分子式等信息相关联，完成谱库构建。
8.7 鉴别
筛选分析依据全扫描（Scan MS）模式下保留时间及精确质量数测定值。如检出的色谱峰保留时间与谱库中的保留时间偏差在±2.5%，且母离子测定精确质量数与理论质量数的相对偏差小于或等于5×10-6（5ppm），则可以初步判断试样中含有该种药物。
8.8 确认
对于初步鉴别出的阳性药物，在二级离子扫描（Target MS/MS）下检测其在不同碰撞能下典型的二级碎片离子（见附录C），如果至少有2个及以上丰度较高的碎片离子测定精确质量数与谱库中相应碎片离子质量数相对偏差小于或等于10×10-6 （10ppm），且上述二级碎片离子与浓度接近的标准工作液中对应的碎片离子的相对丰度一致，即偏差不超过表2规定的范围，且平行试验结果一致的情况下 ，可判定为试样中存在这种药物。
8.9 定量
母离子为定量离子，以73种药物基质匹配标准系列工作溶液（8.3）的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数应不低于0.99。所测样品中药物的响应值应均在该标准曲线的线性范围内。若超出该线性范围，则需减少试样量重新试验或将试样溶液稀释后和基质匹配标准溶液做相应重新测定。
9试验数据处理
试样中药物残留量以ω计，数值以微克每千克（μg/kg）表示，按公式（1）计算：
式中：
ω——试样中被测药物含量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
ρ——由基质标准曲线查得的试样中被测药物浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——提取液体积的数值，单位为毫升（mL）； .
V2——用于氮吹体积的数值.单位为毫升（mL）；
V3——净化后体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
10检出限、定量限和精密度
10.1检出限和定量限
本方法的检出限和定量限应符合附录C的规定。
10.2 精密度.
在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值应不大于该算术平均值的15%。
