中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5493-2023
固体和液体样品中29种*的测定
液相色谱-四级杆/飞行时间质谱法
Determination of 29 * analogs in solid and liquid samples
Liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometr
1 范围
本文件规定了片剂药品、白色粉末化工品、液体饮料样品中29种*(附录A)的液相色谱-四级杆/飞行时间质谱测定方法。
本文件适用于片剂药品、白色粉末化工品、液体饮料样品中29种*的定性和定量测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 方法提要
试样采用乙腈或乙腈-水溶液提取，液相色谱分离，四级杆/飞行时间质谱定性和定量测定，外标法定量。
5 试剂和材料
水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1 乙腈：色谱纯。
5.2 甲醇：色谱纯。
5.3 甲酸：色谱纯。
5.4 氢氧化钠：分析纯。
5.5 10%甲酸水溶液：移取1 mL甲酸(5.3)至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
5.6 1 mol/L氢氧化钠溶液：称取0.40 g氢氧化钠(5.4)，用水溶解，并转移至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
5.7 甲酸钠溶液：分别移取10%甲酸水溶液(5.5)和1 mol/L氢氧化钠溶液(5.6)各1 mL，混匀。
5.8 甲酸钠校正溶液：移取1 mL甲酸钠溶液(5.7)和9 mL乙腈混合均匀。
5.9 乙腈-水溶液(1+9，体积比)：量取10 mL乙腈(5.1)，加入到90 mL水中，混匀。
5.10 0.08%甲酸水溶液：取0.8 mL甲酸(5.3)加入到1 000 mL水溶液中，混匀。
5.11 29种*标准品：应符合附录A，纯度≥95%。
5.12 29种*标准储备溶液：分别准确称取29种*固体标准品(5.11)1 mg(精确至0.01 mg)，用甲醇(5.2)溶解并定容至10 mL，配成浓度为100 μg/mL的标准储备溶液。0 ℃~4 ℃条件下贮存，有效期12个月。
5.13 29种*混合标准中间溶液：吸取标准储备溶液(5.12)20 μL 至10 mL 容量瓶中，用乙腈(5.1)定容至刻度，配成浓度为0.20 μg/mL 的混合标准中间溶液。0 ℃~4 ℃条件下贮存，有效期6个月。
5.14 29种*混合标准工作溶液：吸取混合标准中间溶液(5.13)用乙腈-水溶液(5.9)稀释成适当浓度的混合标准工作溶液。0 ℃~4 ℃条件下贮存，有效期3个月。
5.15 微孔滤膜：0.22 μm，有机相(尼龙)。
5.16 塑料离心管：50 mL。
6 仪器和设备
6.1 液相色谱-四级杆/飞行时间质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。
6.2 分析天平：感量0.01 mg、感量0.01 g。
6.3 离心机：转速不低于5 000 r/min。
6.4 涡旋混合器。
7 试样制备和保存
片剂药品试样：取有代表性的片剂药品试样5粒~10粒，用研钵捣碎、混匀。0 ℃~4 ℃保存。白色粉末化工品和液体饮料试样：0 ℃~4 ℃保存。使用前应充分混合试样，使样品处于均匀状态。
8 分析步骤
8.1 提取
片剂药品类、白色粉末化工品、蛋白饮料：称取试样0.2 g(精确到0.01 g)于50 mL塑料离心管(5.16)中，加入10 mL乙腈(5.1)，在涡旋混合器上涡旋2 min，以4 000 r/min离心5 min，取上清液2 mL过滤膜(5.15)，待测。
液体饮料(除蛋白饮料外)：称取试样0.2 g(精确到0.01 g)于50 mL塑料离心管(5.16)中，加入10mL乙腈-水溶液(5.9)，在涡旋混合器上涡旋2 min，以4 000 r/min离心5 min，取上清液2 mL过滤膜(5.15)，待测。
8.2 仪器参考条件
8.2.1 液相色谱参考条件：
a) 色谱柱：核壳颗粒C18色谱柱，100 mm × 2.1 mm(内径)，粒径2.6 μm，或相当者；
b) 流动相：A 为0.08%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序见表1；
c) 流速：0.4 mL/min；
d) 柱温：40 ℃；
e) 进样体积：10 μL。
8.2.2 质谱参考条件：
a) 离子化模式：电喷雾电离模式(ESI)；
b) 扫描模式：正离子模式(+)；
c) 质谱校正方式：甲酸钠校正溶液(5.8)外标法校正；
d) 校正周期：甲酸钠校正溶液和其他测试溶液参插进样；
e) 采集模式：四级杆/飞行时间质谱一级全扫描(TOF MS)和子离子二级全扫描(TOF MS/MS，
高灵敏度模式)；
f) 扫描时间：一级全扫描 0.25 s，子离子二级全扫描 0.1 s；
g) 扫描质量范围：一级和二级均为50 Da~650 Da；
h) 电喷雾电压(IS)：5 500 V；
i) 离子源温度(TEM)：550 ℃；
j) 雾化气压力(GS1)：50 psi；
k) 辅助气压力(GS2)：60 psi；
l) 气帘气压力(CUR)：40 psi；
m) 去簇电压(DP)：80 V；
n) 碰撞电压(CE)：30±5 V。
8.3 标准工作曲线
将混合标准中间溶液(5.13)用乙腈-水溶液(5.9)稀释成质量浓度为0.001 μg/mL、0.002 μg/mL、0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.020 μg/mL的系列混合标准工作溶液(5.14)。按参考色谱和质谱条件测定。分别以目标化合物质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4 定性
8.4.1 建立一级和二级谱库
输入29种*的分子式和中英文名称，由飞行时间质谱软件计算得到每个化合物母离子([M+H]+ )的精确理论质量数，构建为29种*的一级谱库，见附录A。
29种*混合标准工作溶液(5.14)进行子离子二级全扫描，采集每个化合物的二级碎片离子质谱图，分别导入到质谱库，构建为29种*的二级谱库，完成29种*一级和二级谱库的构建。29种*标准品子离子二级全扫描质谱图见附录B。
8.4.2 鉴别
在一级全扫描(TOF MS)模式下，样品溶液中待测物保留时间与对应浓度的标准工作溶液保留时间偏差在±2.5%之内；待测物母离子([M+H]+ )精确质量数实测值与理论值相对偏差小于或等于5×10-6，则可初步判断试样中含有该种*。
8.4.3 确认
在子离子二级全扫描(TOF MS/MS)模式下，对于初步鉴别出的阳性*，观察其采集到的二级碎片离子质谱图，在相同碰撞电压(CE)下，主要二级碎片离子全部出现，且与其二级谱库匹配(若仪器软件采用匹配度进行计算，推荐匹配度≥70%为匹配；若采用分值进行计算，推荐分值≥70分为匹配)，可判定为试样中存在该种*。
8.5 定量
将标准工作溶液和待测溶液分别注入液相色谱-四级杆/飞行时间质谱仪中，样品中目标化合物质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内，超过标准工作曲线质量浓度上限的样品应用相对应的提取液稀释后进样，采用母离子( [M+H]+ )的峰面积进行计算，外标法定量。同时做空白试验。29种*一级全扫描模式下色谱图见附录C。
8.6 空白试验
除不加试样外，采用完全相同的步骤进行平行操作。
9 结果计算
按公式(1)计算试样中目标化合物含量：
式中：
Xi——试样中目标化合物的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
Ai——试样溶液中目标化合物的峰面积；
Ai0——空白溶液中目标化合物的峰面积；
Ais——标准工作溶液中目标化合物的峰面积；
c——标准工作溶液中目标化合物的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
m——试样质量，单位为克(g)；
V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)。
计算结果应扣除空白值。
10 检出限和定量限
本方法片剂药品和白色粉末化工品中29种*的检出限均为0.025 mg/kg；液体饮料的检出限均为0.01 mg/kg。
本方法29种*的定量限均为0.05 mg/kg。
11 精密度
在重复性条件下，获得的2次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
在再现性条件下，获得的2次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
