中华人民共和国国家标准
GB 31659.5-2022
食品安全国家标准
牛奶中利福昔明残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
National food safety standard-
Determination of rifaximin residue in milk
by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method
1范围
本文件规定了牛奶中利福昔明残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于牛奶中利福昔明残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试料中残留的利福昔明经乙腈提取后，用固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，基质匹配标准溶液外标法定量。
5试剂和材料
5.1试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5. 1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.2 甲酸（CH2O2）：色谱纯。
5. 1.3 无水硫酸钠（Na2SO4）。
5.2溶液配制
5.2.1 20%乙腈溶液：取20 mL乙腈，用水稀释至100 mL。
5.2.2 0.1%甲酸乙腈溶液：取1 mL甲酸，用乙腈稀释至1 000 mL。
5.2.3 0.1%甲酸溶液：取1 mL甲酸，用水稀释至1 000 mL。
5.3 标准品
利福昔明（Rifaximin，C43H51N3O11，CAS号：80621-81-4），含量≥94.0%。
5.4标准溶液的制备
5.4.1标准储备液：取利福昔明标准品约10mg，精密称定，于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1.0 mg/ mL的利福昔明标准储备液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.2标准中间液：精密量取利福昔明标准储备液0.1 mL，于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制浓度为10 μg/mL的标准中间液液。2℃~8℃保存，有效期3个月。
5.4.3标准工作液：精密量取利福昔明标准中间液0.1mL，于10mL容量瓶中，用20%乙腈溶液稀释至刻度，配制浓度为100 ng/mL的标准工作液。2℃~8℃保存，有效期3个月。
5.5材料
5.5.1 亲水亲脂固相萃取柱：500 mg/6 mL，或相当者。
5.5.2亲水型微孔滤膜：0.22 μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
6.2 分析天平：感量0. 00001 g。
6.3 天平：感量0.01 g。
6.4 涡旋混合器。
6.5高速离心机。
6.6氮吹仪。
6.7水平振荡器。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试样品，混匀。
a）取混匀后的供试样品，作为供试试样；
b）取混匀后的空白样品，作为空白试样；
c）取混匀后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1 提取
称取试料2 g（准确至±0.05 g），置于50 mL离心管内，加入8 mL乙腈，再加无水硫酸钠2 g，涡旋后，200转/min水平振荡10 min。6 000 r/min离心8 min，取上清液，备用。
8.2净化与浓缩
亲水亲脂固相萃取柱用5 mL乙腈活化后，取备用液过柱，并接于15 mL玻璃管内，再用3 mL乙腈一并洗脱于同一玻璃管内，挤干，于50℃氮气吹干。残余物用20%乙腈溶液1.0 mL溶解后，过0.22 μm微孔滤膜后上机测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
在空白试料经提取、净化、氮气吹干后的残余物中，依次加入用20%乙腈溶液配制的浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL系列标准溶液各1.0 mL，充分溶解，得到基质匹配标准溶液，过滤膜后上机测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
a）色谱柱：C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），或性能相当者。
b）流动相：A为0.1%甲酸乙腈溶液，B为0.1%甲酸溶液。梯度洗脱程序：0 min~3 min，30%A
线性变化至80%A；3 min~4.5 min 保持30%A。
c）流速：0.3 mL/min。
d）进样量：10μL。
e）柱温：30℃。
8.4.2 串联质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应离子监测（MRM）；
d）电离电压：3.0 kV；
e）源温：110℃；
f）雾化温度：350℃；
g）锥孔气流速：50 L/h；
h）雾化气流速：650 L/h。
利福昔明定性、定量离子对和对应的锥孔电压、碰撞能量参考值见表1。
8.4.3 测定法
试样溶液的保留时间在基质匹配标准溶液保留时间的±2.5%之内。试样溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表2的要求。
取基质匹配标准溶液和试样溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。基质匹配标准溶液及试样溶液中利福昔明的峰面积应在仪器检测的线性范围之内，超出线性范围时应进行适当倍数稀释后再进行分析。基质匹配标准溶液中特征离子质量色谱图见附录A中图A。
8.5空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行测定。
9结果计算和表述
试样中利福昔明的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试样中利福昔明残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
C——基质匹配标准溶液中利福昔明浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
A——试样溶液中利福昔明的峰面积；
V——溶解残余物所用溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；
AS——基质匹配标准溶液中利福昔明的峰面积；
m——试样质量的数值， 单位为克（g）。
10 检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10. 1灵敏度
利福昔明在牛奶中的检测限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg。
10.2准确度
本方法对于牛奶样品在10 μg/kg~120 μg/kg添加浓度上的回收率为70%~ 120%。
10.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
