中华人民共和国国家标准
GB 31659.3-2022
代替GB/T 22989-2008
食品安全国家标准
奶和奶粉中头孢类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
National food safety standard-
Determination of cephalosporins residues in milk and milk powder by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替GB/T 22989-2008《牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，与GB/T 22989-2008 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要变化如下：
——标准文本格式修改为食品安全国家标准文本格式；
——标准范围中增加羊奶的检测；
——标准范围增加药物品种数量；
——标准灵敏度进一步提高。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：
——GB/T 22989-2008。
1范围
本文件规定了牛奶、羊奶和奶粉中头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢乙腈、头孢匹林、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢噻肟残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于牛奶、羊奶和奶粉中头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢乙腈、头孢匹林、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢噻肟残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中的药物残留用磷酸盐缓冲溶液提取，亲水亲脂平衡固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，基质校准外标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5. 1.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
5.1.4正己烷（C6H14）。
5. 1.5 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
5.1.6 氢氧化钠（NaOH）。
5.2 溶液配制
5.2.1 2.5 mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠50 g，加水溶解并稀释至500 mL。
5.2.2 30%乙腈溶液：取乙腈30mL，用水稀释至100mL。
5.2.3 0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH= 8.5）：取磷酸二氢钾6.8 g，用水溶解并稀释至1 000 mL，用2.5 moL/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5。
5.2.4 0.1%甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水稀释至1 000 mL。
5.2.5 0.1%甲酸溶液-甲醇（95：5）：取0.1%甲酸溶液95 mL、甲醇5 mL，混匀。
5.3 标准品
头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢乙腈、头孢匹林、去乙酰基头孢匹林，头孢洛宁、头孢喹肟、头孢噻肟标准品，含量均≥95%，具体见附录A。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液：取标准品各10mg，精密称量，分别用30%乙腈溶液适量使溶解并稀释定容至25mL容量瓶，配制成浓度为400 μg/mL的标准储备液。于-18℃避光保存，有效期1个月。
5.4.2混合标准储备液；分别准确移取各标准储备液0.25mL于10mL容量瓶中，用30%乙腈溶液稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL的混合标准储备液。于-18℃避光保存，有效期7 d。
5.4.3混合标准工作液：准确移取混合标准储备液适量，用0.1%甲酸溶液-甲醇（95：5）稀释成浓度为2.5 μg/L、5.0 μg/L、20 μg/L、100 μg/L、200 μg/L和500 μg/L的系列混合标准工作溶液。现用现配。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：亲水亲脂平衡型固相萃取柱，500mg/6mL，或相当者。
5.5.2针头式过滤器：尼龙材质，孔径0.22μm或性能相当者。
6仪器和设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3氮吹仪。
6.4固相萃取装置。
6.5涡旋混合器。
6.6 离心管：聚丙烯塑料离心管，10 mL、50 mL。
6.7 pH计。
7试样的制备与保存
7.1 试样的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试样品，并均质。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2 试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1 提取
取牛奶、羊奶试料5 g（准确至±0.05 g）或奶粉试料0.5 g（准确至±0.01 g），于50 mL离心管，加磷酸盐缓冲溶液20 mL，涡旋混匀30 s，用2.5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5，备用。
8.2净化
取固相萃取柱，依次用甲醇5 mL、磷酸盐缓冲溶液10 mL活化。取备用液，过柱，待液面到达柱床表面时再依次用磷酸盐缓冲溶液3mL和水2mL淋洗，弃去全部流出液。用乙腈3mL洗脱，收集洗脱液于10 mL离心管中，加正己烷3 mL，涡旋混合1 min，静置5 min，弃去上层正己烷层，取乙腈层在40℃水浴氮气吹干，加0.1%甲酸溶液-甲醇（95：5）1.0mL溶解，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
取空白试料依次按8.1和8.2处理，40℃水浴氮气吹干，分别加系列混合标准工作溶液1.0 mL溶解残渣，过0.22 μm滤膜，制备2.5 μg/L、5.0 μg/L、20 μg/L、100 μg/L、200 μg/L和500 μg/L的系列基质匹配标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱测定。以定量离子对峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：C18色谱柱（100 mm×2.0 mm，1.7μm）或相当者；
b）流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序见表1；
c）流速：0.3 mL/min；
d）柱温：35℃；
e）进样量：10 μL。
8.4.2 质谱参考条件
a）离子源：电喷雾（ESI）离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测（ MRM）；
d）毛细管电压：2 000 V；
e） RF透镜电压：0.5 V；
f）离子源温度：150℃；
g）脱溶剂气温度：500℃；
h）锥孔气流速：50 L/h；
i）脱溶剂气流速：1 000 L/h；
j）二级碰撞气：氩气；
k）定性离子对、定量离子对、碰撞能量和锥孔电压见表2。
8.4.3测定法
取试料溶液和基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以色谱峰面积定量。基质匹配标准溶液及试料溶液中目标药物的特征离子质量色谱峰峰面积均应在仪器检测的线性范围之内，如超出线性范围，应将基质匹配标准溶液和试料溶液作相应稀释后重新测定。试料溶液中待测物质的保留时间与基质匹配标准工作液中待测物质的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且试料溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表3的要求，则可判定为样品中存在对应的待测物质。标准溶液多反应监测色谱图见附录B。
8.5 空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试样中待测药物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
CS——标准溶液中待测药物浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
A——试样溶液中待测药物的峰面积；
V——定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
AS——标准溶液中待测药物的峰面积；
m——试样质量的数值，单位为克（g）。
注：头孢匹林残留量以头孢匹林和去乙酰基头孢匹林之和计。
10检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法中头孢哌酮、头孢乙腈和头孢唑林在奶和奶粉中的检测限分别为2.0μg/kg和20μg/kg，定量限分别为4.0μg/kg和40μg/kg；其余头孢类药物和去乙酰基头孢匹林在奶和奶粉中的检测限分别为0.5 μg/kg和5 μg/kg，定量限分别为1.0 μg/kg和10 μg/kg。
10.2 准确度
本方法在1.0 μg/kg~200 μg/kg添加浓度水平上的回收率为60%~120%。
10.3 精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。
