中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5481-2022
进出口食用动物、饲料中庆大霉素检测方法 液相色谱-质谱/质谱法
Determination of Gentamycin in edible animal and feeds for import and export-LC-MS/MS
前言
本文件按照GB/T 1.1- 2020《标准化工作导则第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国成都海关。
本文件主要起草人：于刚、谭志、李永丽、何开蓉、俞凌云、肖宇、林华、李丹丹。
1范围
本文件规定了食用动物、饲料中庆大霉素残留量的液相色谱质谱/质谱测定方法。
本文件适用于进出口工作中牛、猪、羊、鸡的血清，牛、猪、羊的尿液和猪饲料中庆大霉素的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件；仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 甲醇：色谱纯。
4.2乙腈：色谱纯。
4.3三氯乙酸：优级纯。
4.4七氟丁酸（Heptafluorobutyric acid，HFBA）：HPLC级。
4.5 甲酸：色谱纯。
4.6 标准物质：庆大霉素硫酸盐（C19H39N5O7·H2SO4），含量高于99.0%。
4.7 标准储备溶液：1.0 mg/mL。称取4.6所述标准物质适量，用水配成1.0 mg/mL的标准储备溶液于塑料容量瓶中，2℃~8℃保存。
4.8 标准工作溶液（10.0 μg/mL）：吸取4.7所述各标准储备溶液1 mL于100 mL塑料容量瓶中，用水定容至刻度，2℃~8℃保存。
4.9 三氯乙酸溶液（5%）：称取三氯乙酸10.0 g，用水200 mL，溶解（常温下保存2个月）。
4. 10 七氟丁酸（HFBA）水溶液（500 mmol/L）：准确量取12.8 mL七氟丁酸，用水稀释至200 mL（4℃避光保存，有效期1个月）。
4. 11 七氟丁酸（HFBA）水溶液（50 mmol/L）：准确量取4.10中七氟丁酸溶液10 mL，用水稀释至100 mL（4℃避光保存，有效期1个月）。
4.12 七氟丁酸（HFBA）水溶液（5 mmol/L）：准确量取4.11中七氟丁酸溶液10 mL，用水稀释至100 mL（4℃避光保存，有效期1个月）。
4.13七氟丁酸（ HFBA）水溶液（10 mmol/L）：准确量取50 mmol/L七氟丁酸溶液10 mL，用水稀释至100mL。
4.14 HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）。
4.15 0.22μm水相滤膜。
5仪器设备
5.1 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源。
5.2 天平：感量分别为0.01 g和0.000 1 g。
5.3氮吹浓缩仪。
5.4 高速冷冻离心机（最高转速可达15 000 r/min）。
5.5 固相萃取装置。
6样品的采集与保存
6.1血样的采集
采集动物血样约10 mL，待自然凝固后分离血清，分装于聚四氟乙烯材质小管，加盖密封。
6.2 尿样的采集
采集动物尿样约10 mL，12 000 r/min离心10 min后，上清液分装于聚四氟乙烯材质小管，加盖密封。
6.3 饲料试样
采集饲料样品约500g。在实验室粉碎混匀，四分法至约20 g后分装于小塑料袋，密封。
6.4试样的保存
将分装后的血情、尿样于-20℃保存，饲料样品于4℃保存。
7测定步骤
7.1 提取
7.1.1血清和尿样试样
称取约2 g血清或尿样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入3 mL三氯乙酸溶液（4.9）.涡旋振荡1 min，在4℃下10000 r/min离心5 min，取上清液置于15 mL离心管中。用2 mL三氯乙酸溶液重复提取1次，合并提取液，加2 mL七氟丁酸（HFBA）水溶液（4.11），混匀，备用。
7.1.2饲料试样
称取约2 g试样（精确至0.01 g），加入5 mL 三氯乙酸溶液（4.9），涡旋振荡3 min，在4℃下以10 000 r/min离心5 min，取上清液层置于15 mL塑料离心管中。用5 mL三氯乙酸溶液（4.9）重复提取1次，合并提取液，加2 mL七氟丁酸（HFBA）水溶液（4.11），混匀，备用。
7.2净化
固相萃取柱（HLB）（4.14）依次用甲醇、水、七氟丁酸（ HFBA）水溶液（4. 12）各3 mL活化，取备用液上柱，用水5 mL淋洗，甲醇3 mL洗脱，收集洗脱液于塑料离心管中，置于40℃水浴中轻微氮气流吹干，用七氟丁酸（HFBA）水溶液（4.12）1.0 mL溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤后，待测。
7.3基质工作曲线的配制
取空白试样（不含有庆大霉素的动物生物样品或饲料），按7.1和7.2进行提取净化，获得基质提取液。分别吸取适量标准工作溶液（4.8），依次加入相应试剂瓶中，用基质提取液定容至1.0 mL获得0.05 mg/L、0.2 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和5.0 mg/L的系列基质标准工作溶液。
7.4测定条件
7.4.1液相色谱质谱参考条件
7.4. 1.1 色谱柱：C18，3μm，2.1×100 mm，或相当者。
7.4. 1.2流速：0.3 mL/min。
7.4.1.3 柱温箱温度：35℃。
7.4.1.4 进样量：5 μL。
7.4. 1.5 流动相：10 mmol/L HFBA水溶液（A）和乙腈（B）。梯度洗脱条件见表1。
7.4.1.6 离子源：电喷雾离子源。
7.4.1.7 扫描方式：正离子扫描。
7. 4. 1.8 检测方式：多反应监测。
7.4.1.9 电喷雾电压：5 500 V。
7.4.1.10 气帘气压力：20 psi。
7.4.1.11 辅肋气压力：GAS1.60 psi；GAS2.60 psi。
7.4.1.12 离子源温度：550℃。
7.4. 1.13 定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量，见表2。
7.4.2 测定
7.4.2.1定性测定
在相同试验条件下，样品溶液中的被测物的保留时间与基质标准工作溶液中被测物的保留时间比值，偏差在±2.5%之内。待测样品溶液中，被测物中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度的比值，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在庆大霉素。
7. 4.2.2 定量测定
在相同的仪器工作条件下，以基质标准溶液中被测组分峰面积为纵坐标，以对应的标准溶液浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中庆大霉素的响应值在仪器测定的线性范围内。在上述色谱和质谱条件下，庆大霉素（组分C1）的提取离于色谱图见附录A。
7.5空白试验
除不加试样溶液外，均按上述操作步骤进行。
8结果计算
庆大霉素的含量用色谱数据处理软件外标法计算或按式（1）计算：
式中：
X——试料中庆大霉素残留量，单位为亳克每千克（mg/kg）；
A——试样溶液中庆大霉素的峰面积；
Cs——标准工作液中庆大霉素的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V——溶解残余物所得试样溶液体积，单位为亳升（mL）；
As——标准工作液中庆大霉素的峰面积；
W——样品质量，单位为克（g）。
9检测限、定量限、回收率和精密度
9.1 检测限和定量限
本方法对血清、尿样和猪饲料中庆大霉素的检测限为0.025 mg/kg，定量限为0.05 mg/kg。
9.2回收率和精密度
牛、猪、羊和鸡血清，牛、猪、羊尿液和猪饲料中庆大霉素类药物的添加回收率和精密度见附录B。
