中华人民共和国国家标准
GB 31613.5-2022
食品安全国家标准 鸡可食性组织中抗球虫药物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
National food safety standard-
Determination of coccidiostats residues in chicken edible tissues by
liquid chromatography-tandem mass spectrometric method
1 范围
本文件规定了鸡可食组织中常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马度米星铵和拉沙洛西7种抗球虫药物残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于鸡肌肉、肝脏和皮脂（皮+脂）中常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马度米星铵和拉沙洛西7种抗球虫药物残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的抗球虫药物经胰蛋白酶酶解，乙酸乙酯提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法检测，基质匹配外标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1 试剂
5.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.3 乙酸（CH3COOH）：色谱纯。
5.1.4甲酸（HCOOH）：色谱纯。
5.1.5乙酸乙酯（CH3CH2OOCCH3）：色谱纯。
5.1.6胰蛋白酶：来源于牛胰腺，≥10000 U/mg。
5.1.7碳酸钠（Na2CO3）。
5.2溶液配制
5.2.1 10%碳酸钠溶液：取碳酸钠20 g，加水适量使溶解并稀释至200 mL，混匀。
5.2.2 1%乙酸溶液：取乙酸1 mL，用水稀释至100 mL，混匀。
5.2.3 20%甲醇溶液：取甲醇20 mL，用水稀释至100 mL，混匀。
5.2.4 洗脱液：取甲醇100 mL，加乙酸乙酯200 mL，混匀。
5.2.5 复溶液：取甲醇50 mL，加水50 mL、甲酸0.1 mL，混匀。
5.3 标准品
常山酮、氨苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马度米星铵、拉沙洛西含量≥95%。具体见附录A。
5.4 标准溶液制备
5.4.1 标准储备液（1 mg/mL）：取常山酮、氯苯胍、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马度米星铵、 拉沙洛西标准品适量（相当于各有效成分10 mg），精密称定，分别加甲醇适量使溶解并稀释定容于10 mL容量瓶，配制成浓度均为1 mg/mL 的标准储备液。-18℃以下避光保存，有效期6个月。
5.4.2混合标准工作液（10μg/ mL） ：分别精密量取标准储备液各0.1 mL，于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL的混合标准工作液。-18℃以下避光保存，有效期6个月。
5.4.3混合标准工作液（1 μg/mL）：精密量取10 μg/mL的混合标准工作液1 mL，于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1 μg/mL的混合标准工作液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。
5.4.4混合标准工作液（0.1μg/ mL） ：精密量取1 pug/mL的混合标准工作液1 mL，于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为0.1pug/mL的混合标准工作液。-18℃以下避光保存，有效期1个月。
5.5 材料
5.5.1 三键键合C18固相萃取柱：500 mg/6 mL，或相当者。
5.5.2尼龙微孔滤膜：0.22 μm。
6仪器和设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2 分析天平：感量0.01 g和0.00001 g。
6.3高速冷冻离心机：10000 r/min。
6.4组织匀浆机。
6.5涡旋混合器。
6.6固相萃取装置。
6.7氮吹仪。
6.8 水浴摇床。
6.9 pH计。
7试样的制备与保存；
7.1试样的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎并均质。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；.
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2 试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1 提取
称取试料1 g（准确至±0.01 g），加胰蛋白酶25 mg、水5 mL，涡旋1 min，用10%碳酸钠溶液调pH至7.5，40℃水浴过夜酶解。取出放至室温，加10%碳酸钠溶液1 mL，涡旋1 min。加乙酸乙酯9 mL，涡旋5min，于4℃、10000 r/min离心10 min，转移上清液，残渣重复提取1次。合并2次提取液，用乙酸乙酯稀释至20.0 mL，混匀。取提取液2.0 mL于35℃水浴氮气吹干，加乙腈1 mL涡旋1 min， 加水10 mL，混匀，备用。
8.2 净化
固相萃取柱依次用甲醇5 mL.1%乙酸溶液5 mL活化，取备用液全部过柱，控制流速为每2 s~3 s 1滴。用1%乙酸溶液3 mL和20%甲醇溶液3 mL淋洗，用洗脱液10 mL洗脱。收集洗脱液，35℃水浴氮气吹干，加复溶液1.0 mL涡旋1 min，于-4℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液，过滤膜后供液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
取6份空白样品经提取和净化后，加入适量的标准工作液，35℃水浴氮气吹干，加复溶液1.0 mL涡旋1 min，配制成浓度为0.5 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、25 μg/L和50 μg/L的基质匹配标准溶液，于-4℃、10000r/min离心10min，取上清液，过滤膜后供液相色谱-串联质谱测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为橫坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1液相色谱参考条件
色谱柱：C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），或相当者；
流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱：梯度洗脱程序见表1；
流速：0.3 mL/ min；
柱温：30℃；
进样量：10 μL。
8.4.2 质谱参考条件
a）离子源：电喷雾（ESI）离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测；
d）电离电压：4.0 kV；
e）离子源温度：100℃；
f）雾化温度：350℃；
g）锥孔气流速：30 L/h；
h）雾化气流速：600 L/h；
i）待测药物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量的参考值见表2。
8.4.3 测定法
8.4.3. 1定性测定
在同样测试条件下，试料溶液中抗球虫药物的保留时间与基质匹配标准工作液中抗球虫药物的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致。其允许偏差应符合表3的要求。
8.4.3.2 定量测定.
取试料溶液和基质匹配标准工作液，作单点或多点校准，按外标法定量。基质匹配标准工作液及试料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱质谱条件下，标准溶液特征离子质量色谱图见附录B。
8.5空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中抗球虫药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试样中抗球虫药物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
A——试样中抗球虫药物的峰面积；
CS——基质匹配标准溶液中抗球虫药物浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
V1——提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；
V2——分取提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；
V——复溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；
A——基质匹配标准溶液中抗球虫药物的峰面积；
m——试样质量的数值，单位为克（g）。
10 方法灵敏度、准确度和精密度
10.1 灵敏度
本方法的检测限为5μg/kg，定量限为10μg/kg。
10.2准确度
本方法在10 μg/kg~100 μg/kg添加浓度水平上的回收率为60% ~120%。
