中华人民共和国国家标准
GB 31658.19-2022
食品安全国家标准
动物性食品中阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、利多卡因、普鲁卡因残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
National food safety standard-
Determination of atropine， scopolamine， anisodamine，
lidocaine， procaine residues in animal derived food- -Liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method
1 范围
本文件规定了动物性食品中阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、利多卡因、普鲁卡因残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱检测方法。
本文件适用于猪、牛、羊的肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、利多卡因、普鲁卡因单个或多个药物残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的待测物经磷酸盐缓冲液提取，PEP-2固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱测定，外标法定量。
5试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。
5.1.4磷酸二氢钾（KH2PO4）。
5.1.5磷酸氢二钾（K2HPO4·H2O）。
5.1.6磷酸（H3PO4）。
5.2溶液配制
5.2.1 0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲液：取磷酸二氢钾13.6 g，加水900 mL使溶解，用磷酸调节pH至4. 0±0.05，用水稀释至1 000 mL，混匀。
5.2.2 0.2 mol/L磷酸氢二钾溶液：取磷酸氢二钾22.8 g，加水溶解并稀释至500 mL，混匀。
5.2.3 5%甲醇溶液：取甲醇5 mL，加水稀释至100 mL，混匀。
5.2.4 30%乙腈溶液：取乙腈30 mL，加水稀释至100 mL，混匀。
5.2.5 0. 1%甲酸溶液：取甲酸0.5 mL，加水稀释至500 mL，混匀。
5.3 标准品
阿托品（Atropine，C17H23NO3，CAS号：51-55-8）、东莨菪碱（Scopolamine，C17H21NO4，CAS号：51-34-3）、山茛菪碱（Anisodamine，C17H24NO4，CAS号：55869-99-3）、利多卡因（Lidocaine C14H22N2 O，CAS号：137-58-6）、普鲁卡因（Procaine，C13H20N2O2 ，CAS号：59-46-1），含量均≥99%。标准品也可为相应的盐。
5.4标准溶液配制
5.4.1标准储备液：取阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、利多卡因、普鲁卡因标准品各适量（相当于各活性成分约10mg），精密称定，加甲醇适量使溶解并稀释定容至10mL容量瓶，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液。- 18℃避光保存，有效期6个月。
5.4.2混合标准中间液：准确量取标准储备液各1mL，于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL的混合标准工作液。-18℃避光保存，有效期1个月。
5.4.3 系列标准工作液：准确量取混合标准中间液适量，用30%乙腈溶液稀释， 配制成浓度分别为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的系列标准溶液。现配现用。
5.5材料
5.5.1 PEP-2固相萃取柱：填料为官能化聚苯乙烯/二乙烯苯，60 mg/3 mL，或相当者。
5.5.2微孔尼龙滤膜：0.22μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2 分析天平：感量0. 01g和0.00001 g。
6.3 涡旋混合器。
6.4涡旋振荡器。
6.5高速冷冻离心机：转速可达10 000 r/min。
6.6固相萃取装置。
6.7组织匀浆机。
6.8 pH计。
7试料的制备与保存
7.1试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。
a）取均质后的供试样品，作为供试试料；
b）取均质后的空白样 品，作为空白试料；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。
7.2试料的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1提取
取试料2 g（准确至±0.05 g）于50 mL离心管中，准确加入0.1 mol/L 磷酸二氢钾缓冲液20 mL（脂肪样品在60℃水浴加热10 min），涡旋1 min，振荡10 min，4℃下10000 r/min离心10 min。准确移取10 mL上清液至另一离心管中，加入0.2 mol/L磷酸氢二钾溶液5 mL，混匀后备用。若溶液浑浊，10000 r/min离心10 min，取上清液备用。
8.2 净化
PEP-2固相萃取柱分别用甲醇3 mL、水3 mL活化，移取全部备用液，过柱，用水3 mL、5%甲醇溶液3mL淋洗，抽干，准确移取30%乙腈溶液2mL洗脱，抽干，收集洗脱液，过微孔尼龙滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
准确移取系列标准工作液各100 μL，用经8.1~8.2步骤处理后的空白试样洗脱液稀释至1 mL，配制成浓度为0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL.5 ng/mL和10 ng/mL的系列基质匹配标准溶液，过微孔尼龙滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。以各药物特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4. 1液相色谱参考条件
a）色谱柱：C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm），或相当者；
b）柱温：35℃；
c）进样量：2μL；
d）流速：0.3 mL/min；
e）流动相：A为0. 1%甲酸溶液；B为甲醇。梯度洗脱程序见表1。
8.4.2
质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测；
d）喷雾电压：1.0 kV；
e）鞘气：30 Arb；
f）辅助气：5 Arb；
g）离子迁移管温度：325℃；
h）雾化温度：300℃；
i）待测药物的保留时间、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量的参考值见表2。
8.4.3 测定法
8.4.3.1定性测定
在同样测试条件下，试料溶液中待测物药物峰的保留时间与基质匹配标准溶液相应峰的保留时间相对偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。
8.4.3.2定量测定
取试料溶液和相应的基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以色谱峰面积定量。基质匹配标准工作液及试样溶液中待测物响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，基质匹配标准溶液的特征离子质量色谱图见附录A。
8.5空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用相同的测定步骤进行测定。
9结果计算和表述
试样中待测物残留量按标准曲线或公式（1）计算：
式中：
X——试样中待测物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
Cs——基质标准溶液中待测物浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
A——试样溶液中待测物的峰面积；
As——基质标准溶液中待测物的峰面积；
V——洗脱液体积的数值，单位为毫升（mL）；
V1——净化用提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；
V2——试样提取液总体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）。
10检测方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法在猪、牛、羊的肌肉和脂肪组织中的检测限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg；在猪、牛、羊的肾脏和肝脏组织中的检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。
10.2准确度
本方法在猪、牛、羊的肌肉和脂肪组织0.5μg/kg~5μg/kg添加浓度水平上的回收率为60%~120%；在猪、牛、羊的肾脏和肝脏组织1.0μg/kg~10μg/kg添加浓度水平上的回收率为60%~120%。
10.3精密度
本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
