中华人民共和国国家标准
GB 31658.21-2022
食品安全国家标准
动物性食品中左旋咪唑残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
National food safety standard-
Determination of levamisole residue in animal derived food
by liquid chromatography- tandem mass spectrometry method
1范围
本文件规定了动物性食品中左旋咪唑残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、禽、牛、羊的肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织中左旋咪唑残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的左旋咪唑，在碱性条件下用乙酸乙酯提取，0.1 mol/L盐酸溶液萃取，混合型阳离子交换固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。
5试剂或材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。
5.1 试剂
5. 1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5.1.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。
5.1.4 乙酸乙酯（C4H8O2）。
5.1.5 无水硫酸钠（Na2SO4）。
5. 1.6 碳酸氢钠（NaHCO3）。
5. 1.7 碳酸钠（Na2CO3）。
5.1.8 盐酸（HCI）。
5.1.9 氨水（NH3·H2O）。
5.2溶液配制
5.2.1碳酸氢钠饱和溶液：取水100mL，加无水碳酸氢钠至不溶解为止，取上清液，现用现配。
5.2.2碳酸钠饱和溶液：取水100mL，加碳酸钠至不溶解为止，取上清液，现用现配。
5.2.3碳酸盐缓冲液：取碳酸氢钠饱和溶液90mL、碳酸钠饱和溶液10mL，混匀。
5.2.4 0. 1mol/L盐酸溶液：取盐酸9 mL，加水稀释至1 000 mL，混匀。
5.2.5 4%氨水甲醇溶液：取氨水4mL，用甲醇稀释至100mL，混匀，现用现配。
5.2.6 0.1%甲酸溶液：取甲酸500μL，用水稀释至500mL，混匀。
5.2.7 10%乙腈甲酸溶液：取乙腈10mL，用0. 1%甲酸水溶液稀释至100 mL，混匀。
5.3 标准品
盐酸左旋咪唑（Levamisole hydrochloride， C11H12N2S·HCl，CAS号：16595-80-5），含量≥99%。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液：取盐酸左旋咪唑标准品适量（相当于左旋咪唑约10mg），精密称定，加甲醇适量使溶解并稀释定容至10 mL容量瓶，配制成浓度为1 mg/mL的左旋咪唑标准储备液。-18℃保存，有效期6个月。
5.4.2 标准工作液：精密量取标准储备液1 mL，于100 mL容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/ mL的左旋咪唑标准工作液。4℃保存，有效期3个月。
5.5材料
5.5.1 混合型阳离子交换固相萃取柱：60 mg/3 mL，或相当者。
5.5.2陶瓷均质子。
5.5.3微孔尼龙滤膜：0.22 μm。
6仪器设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离源。
6.2 分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3涡旋混合器。
6.4涡旋振荡器。
6.5高速冷冻离心机：转速≥10000 r/min。
6.6固相萃取装置。
6.7氮吹仪。
7试样的制备与保存
7.1试样制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并均质。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试样。
7.2试样保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1提取
取试料2 g（准确至±0.05 g），于50 mL聚丙烯离心管中（脂肪样品需在60℃水浴下加热20 min），加入一粒陶瓷均质子，加碳酸盐缓冲液0.5mL，无水硫酸钠2g，乙酸乙酯10mL，涡旋1min，振荡5min，6000 r/min离心5 min，取上层乙酸乙酯至另一离心管，残渣用乙酸乙酯10 mL重复提取一次，合并两次提取液，加0.1 mol/L盐酸溶液5 mL，振荡5 min，6 000 r/min离心5 min，取下层水相至另一离心管中，有机相中再加0.1 mol/L 盐酸溶液5 mL重复萃取一次，合并两次萃取液，备用。
8.2 净化
取混合型阳离子交换固相萃取柱，依次用甲醇3 mL、0. 1mol/L盐酸溶液3 mL活化。取备用液过柱，流速控制在1 mL/min~2 mL/ min，依次用水3 mL.甲醇3 mL淋洗，抽干，4%氨水甲醇溶液3 mL洗脱，抽干，收集洗脱液，40℃下氮气吹干。用10%乙腈甲酸溶液1.0 mL溶解残余物，超声1 min，过0.22μm微孔尼龙滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
精密量取标准工作液适量，用甲醇稀释，配制成浓度分别为10ng/mL、20 ng/mL、50ng/ mL、
100ng/mL、200ng/mL和500ng/mL的系列标准溶液，各取100μL，分别加于经提取、净化步骤处理的空白试料洗脱液中，于40℃下氮气吹干，用10%乙腈甲酸水溶液1.0 mL溶解残余物，超声1 min，混匀。配制成浓度分别为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL的基质匹配标准溶液，过微孔尼龙滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。以左旋咪唑定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为橫坐标，绘制基质匹配标准曲线。求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
a）色谱柱：C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm），或相当者；
b）柱温：35℃；
c）进样量：2 μL；
d）流速：0.30 mL/min；
e）流动相：A为0.1%甲酸溶液；B为甲醇；梯度洗脱程序见表1。
8.4.2 质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测；
d）离子源温度：150℃；
e）脱溶剂温度：500℃；
f）毛细管电压：0.8 kV；
g）定性离子对、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量见表2。
8.4.3测定法
8.4.3.1定性测定
在同样测试条件下，试料溶液中左旋咪唑的保留时间与基质匹配标准工作液中的保留时间相对偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。
8.4.3.2定量测定
取试料溶液和相应的基质匹配标准工作液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积定量，基质匹配标准工作液及试料溶液中的左旋咪唑响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，左旋咪唑基质匹配标准溶液的特征离子质量色谱图见附录A。
8.5 空白试验
除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行测定。
9结果计算和表述
试样中待测物残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试样中左旋咪唑残留量的数值，单位为微克每千克（ug/kg）；
A——试样中左旋咪唑定量离子峰面积；
A——基质匹配标准溶液中左旋咪唑定量离子峰面积；
C——基质匹配标准溶液中左旋咪唑浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——最终试样定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）。
10检测方法灵敏度、准确度和精密度
10.1 灵敏度
本方法的检测限为0.5 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。
10.2准确度
本方法左旋咪唑在肌肉、肾脏和脂肪组织1.0μg/kg~10μg/kg添加浓度水平上的回收率为60%~120%，10μg/kg~20μg/kg添加浓度水平上的回收率为70%~110% ；在肝脏组织1.0μg/kg~10μg/kg添加浓度水平上的回收率为60%~120%，10μg/kg~200μg/kg添加浓度水平上的回收率为70% ~110%。
10.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
