中华人民共和国国家标准
GB 5009.296-2023
食品安全国家标准 食品中维生素D的测定
前言
本标准代替GB 5009.82-2016《 食品安全国家标准食 品中维生素A、D、E的测定》中第三法“食品中维生素D的测定液相色谱-串联质谱法"和第四法“食品中维生素D的测定高效液相色谱法"。
本标准与GB 5009.82-2016相比，主要变化如下：
——标准名称修改为《食品安全国家标准 食品中维生素D的测定》；
——增加了在线柱切换-反相液相色谱法；
——增加了样品预制备方法；
——修改了液相色谱-串联质谱法的线性范围和仪器参考条件；
——修改了附录中标准校正溶液的配制方法。
1范围
本标准规定了食品中维生素D的测定方法。
第一法正相色谱净化反相液相色谱法适用于添加了麦角钙化醇或胆钙化醇的食品中维生素D2和维生素D3的测定。
第二法在线柱切换-反相液相色谱法适用于食品中维生素D2和维生素D3的测定。
第三法液相色谱-串联质谱法适用于食品中维生素D2和维生素D3的测定。
第一法 正相色谱净化-反相液相色谱法
2原理
试样经氢氧化钾乙醇溶液皂化，液液萃取净化、浓缩后，用正相高效液相色谱仪通过硅胶柱将维生素D与其他杂质分离，将收集的馏分浓缩后，再经反相色谱柱分离维生素D2与维生素D3，紫外检测器检测，内标法（或外标法）定量。当试样中不含维生素D2时，可用维生素D2作内标测定维生素D3；当试样中不含维生素D3时，可用维生素D3，作内标测定维生素D2。否则，用外标法测定。
3试剂和材 料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1无水乙醇（C2H6O）：色谱纯。
3.1.2抗坏血酸（C6H8O6）。
3.1.3 2，6-二叔丁基对甲酚（C15H24O）：简称BHT。
3.1.4 a-淀粉酶（CAS号：9000-90-2，中温淀粉酶，来源于芽孢杆菌属）：酶活力≥1.5 U/mg。
3.1.5氢氧化钾（KOH）。
3.1.6正己烷（C6H14）。
3.1.7甲醇（CH4O）：色谱纯。
3.1.8无水硫酸钠（Na2SO4）。
3.1.9环己烷（C6H12）。
3.1.10异丙醇（C3H8O）。
3.1.11石油醚：沸程为30℃~60℃。
3.2试剂配制
3.2.1氢氧化钾溶液（50%，质量分数）：称取50 g氢氧化钾，溶于50 g水中，冷却后储存于聚乙烯瓶中。
3.2.2 BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL）：称取1.0 g BHT，溶于500 mL无水乙醇中，临用前配制。
3.2.3异丙醇-环己烷-正己烷溶液（2+125+125） ：将异丙醇、环己烷和正己烷按2：125：125的体积比混合均匀，超声脱气。
3.2.4甲醇-水溶液（19+1）：将甲醇和水按19：1的体积比混合均匀，超声脱气。
3.3 标准品
3.3.1维生素 D2标准品：麦角钙化醇（C28H44O，CAS号：50-14-6），纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2维生素D3标准品：胆钙化醇（C27H44O，CAS号：67-97-0），纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4 标准溶液配制
3.4.1维生素D2标准储备溶液（1000 mg/L）：准确称取50 mg（精确至0.1 mg）维生素D2标准品于小烧杯中，用无水乙醇溶解并转移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀。按附录A进行储备液浓度校正，将该储备溶液装至棕色试剂瓶中，密封后在-18℃下避光保存，保存期6个月。
3.4.2维生素D3标准储备溶液（1000 mg/L）：准确称取50 mg（精确至0.1 mg）维生素D3标准品于小烧杯中，用无水乙醇溶解并转移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀。按附录A进行储备液浓度校正，将该储备溶液装至棕色试剂瓶中，密封后在-18℃下避光保存，保存期6个月。
3.4.3维生素D2标准使用液（10.0 mg/L）：准确吸取维生素D2 标准储备液（1000 mg/L）1.00 mL于100 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，混匀。在-18℃下避光保存，保存期3个月。
3.4.4维生素D3标准使用液（10.0 mg/L）：准确吸取维生素D3标准储备液（1000 mg/L）1.00 mL于100 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，混匀。在-18℃下避光保存，保存期3个月。
3.4.5标准系列工作溶液
3.4.5.1当用维生素 D3作内标测定维生素D2时：分别吸取维生素D2标准使用液（10.0 mg/L）
0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL.4.00 mL、6.00 mL和10.00 mL于100 mL棕色容量瓶中，各加入维生素D3内标使用液（10.0 mg/L）2.50 mL，加甲醇稀释至刻度，混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、600 μg/L、1 000 μg/L，维生素D3内标质量浓度为250 μg/L。临用前配制。
3.4.5.2当用维生素 D2 作内标测定维生素D3时：分别吸取维生素D3标准使用液（10.0 mg/L）
0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL和10.00 mL于100 mL棕色容量瓶中，各加入维生素D2内标使用液（10.0mg/L）2.50mL，加甲醇稀释至刻度，混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、600 μg/L、1 000 μg/L，维生素D2内标质量浓度为250 μg/L。临用前配制。
3.4.5.3当用外标法同时测定维生素D2和D3时：分别吸取维生素D2标准使用液（10.0 mg/L）、维生素D3，标准使用液（10.0 mg/L）各0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL和10.00 mL于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、600 μg/L、1 000 μg/L。临用前配制。
3.5材料
3.5.1广泛pH试纸：pH范围1~14。
3.5.2玻璃层析柱：柱径 2 cm~3 cm，柱长10 cm~15 cm。
3.5.3微孔滤膜：有机系 ，孔径0.45 μm。
4仪器和设备
4.1正相高效液相色谱仪：带紫外检测器，进样器配500 μL定量环。
4.2反相高效液相色谱仪：带紫外检测器，进样器配100 μL定量环。
4.3天平：感量为0.1 mg、0.01 g。
4.4紫外分光光度计：带 1 cm石英比色皿。
4.5磁力搅拌器：带加热、控温功能。
4.6恒温振荡器。
4.7旋转蒸发仪。
4.8恒温水浴锅。
4.9氮吹浓缩仪。
4.10超声波清洗器。
4.11分液漏斗萃取振荡器。
5分析步骤
5.1样品前处理
处理过程应避免紫外光照射。
5.1.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品袋中，避光冷藏，尽快测定。
5.1.1.1婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料
固体试样：称取均质后的试样约25 g（m1，精确至0.01 g）至250 mL干燥玻璃瓶中，加入约200 mL温水（40℃~45℃），记录加水后的溶液质量（m2，精确至0.01 g）。充分混匀溶解，室温避光放置
15 min，每隔5 min振摇30 s。称取制备后的浆液20 g~50 g（ms，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶中。按式（1）计算样品质量（m）。
液体试样：称取摇匀后的试样20 g~50 g（m，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶中。
5.1.1.2谷物及其制品、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样
称取均质后的试样5 g~10 g（m ，精确至0.01 g）于150 mL平底烧瓶中，加入约20 mL温水（40℃~45℃），混匀。婴幼儿谷类辅助食品可参考5.1.1.1先制成浆液，再称取制备后的浆液20g~50g（ms，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶中。
5.1.1.3 其他食品
称取均质后的固体试样5g~20 g（m，精确至0.01 g）或液体试样20 g~50 g（m，精确至0.01 g） 于150mL平底烧瓶中，固体试样需加入20mL~30mL温水（40℃~45℃），混匀。
5.1.2试样皂化
5.1.2.1婴幼儿配方食品 、特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品、饮料和其他食品于5.1.1.1和5.1.1.3所述平底烧瓶中，加入100 μL内标使用溶液（10.0 mg/L），再加入1.0 g抗坏血酸和30 mL~50 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），混匀，再加入20 mL~30 mL氢氧化钾溶液（50%，质量分数） ，边加边振摇，混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化，温度80℃±2℃，时间30 min（或温度25℃±5℃，时间16 h±2 h），皂化后立即用冷水冷却至室温。
5.1.2.2谷物及其制品、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样
于5.1.1.2所述平底烧瓶中，加入100 μL内标使用溶液（10.0 mg/L）和1.0g a-淀粉酶，放入60℃恒温水浴振荡30 min，向酶解液中加入1.0 g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），混匀，再加入10mL~20mL氢氧化钾溶液（50%，质量分数），边加边振摇，混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化，温度80℃±2℃，时间30 min（或温度25℃±5℃，时间16 h±2 h），皂化后立即用冷水冷却至室温。
注：如用外标法，则不加内标，其余操作同上，皂化条件选择温度25℃±5℃，皂化时间16 h±2 h。
5.1.3试样提取与浓缩
5.1.3.1 试样提取
将上述皂化液用30 mL水转入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振荡萃取5 min，将下层溶液转移至另一250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚重复萃取1次~2次，合并石油醚层。用约150 mL水洗涤石油醚层，去除下层水相，重复洗涤至少3次，直至将石油醚层洗至中性（可用广泛pH试纸检测下层溶液）。
5.1.3.2试样浓缩
将洗涤后的石油醚层缓慢流过预先填充厚度3 cm~5 cm无水硫酸钠粉末的玻璃层析柱，滤入250 mL旋转蒸发瓶或氮吹浓缩管中，用15 mL石油醚冲洗分液漏斗及玻璃层析柱内无水硫酸钠2次，合并入蒸发瓶或氮吹浓缩管中，并将其接在旋转蒸发仪或氮吹浓缩仪上，于40℃水浴中旋蒸或氮吹浓缩，待石油醚剩余约1 mL时，取下蒸发瓶或浓缩管，用石油醚将浓缩液转移至2 mL容量瓶中，氮吹至近干，用正己烷定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，供正相高效液相色谱净化。
5.2仪 器参考条件
5.2.1维生素 D待测液的净化
5.2.1.1正相色谱参考条件
正相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：硅胶柱，柱长250 mm，柱内径4.6 mm，粒径5 μm，或相当者；
b）流动相：异丙醇-环己烷正己烷溶液（2+ 125+125）；
c）流速：1.0 mL/ min；
d）波长：264 nm；
e）柱温：35℃；
f）进样量：500 μL。
5.2.1.2正相色谱系统适用性试验
各取维生素D2标准使用液和维生素D3标准使用液200μL于10 mL具塞试管中，40℃水浴中氮气吹至近干。残渣用10 mL正己烷振荡溶解。取该溶液500μL注入正相高效液相色谱仪中测定，确定维生素D2和维生素D3的保留时间。
5.2.1.3试样待测液正相色谱净化
将500μL待测液注入正相液相色谱仪中，根据维生素D2和维生素D3标准溶液保留时间收集维生素D2和维生素D3馏分于试管中。将试管置于40℃水浴中氮气吹至近干，准确加入1.0 mL甲醇，振荡溶解残渣，即为试样测定液。
注：全自动（在线）或半自动（离线）的馏分收集器可优化操作参数后使用。
5.2.2反相液相色谱参考条件
反相液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：多环芳烃（PAH）C18柱，柱长150 mm，柱内径4.6 mm，粒径5μm，或相当者；
b）流动相：甲醇-水溶液（19+1）；
c）流速：1.0 mL/ min；
d）波长：264 nm；
e）柱温：35℃；
f）进样量：100 μL。
5.3标准曲线的制作
将标准系列工作溶液分别注入反相液相色谱仪中，内标法以标准系列工作溶液中维生素D2（或维生素D3）与其对应内标的质量比为横坐标，以维生素D2（或维生素D3）的峰面积与其对应内标的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。外标法以标准系列工作溶液中维生素D2（或维生素D2）的浓度为横坐标，维生素D2（或维生素D3 ）的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。维生素D2和维生素D3标准溶液的色谱图参见附录B中图B.1。
5.4试样溶液的测定
5.4.1定性分析
将试样溶液注入液相色谱仪中进行测定，同样测试条件下，试样溶液中维生素D2、维生素D3的保留时间与标准工作溶液中相应的保留时间相比，偏差应在±2.5%以内。
5.4.2 定量测定
将试样溶液注入反相液相色谱仪中，得到维生素D2（或维生素D3）的峰面积，根据相应的标准曲线得到试样溶液中维生素D2（或维生素D3）的浓度。试样溶液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围。可适当减少取样量重新测定。
5.5空白试验
不称取试样，按试样的皂化、提取和浓缩分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。内标法需要做不加内标的样品试验，确认加入内标的可行性。
6分析结果的表述
试样中维生素D2（或维生素D3）的含量，内标法按式（2）和式（3）计算，外标法按式（4）计算。
式中：
X——试样中维生素D2（或维生素D）的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；
N——试样溶液中维生素D2（或维生素D3）与其对应内标的峰面积比值对应的质量，单位为纳克（ng），按式（3）计算；
100——由每克换算为每百克的换算系数；
m——试样的取样量，单位为克（g）；
1000——由ng换算为μg的换算系数。
式中：
K——从标准曲线查得的质量比；
N——试样中加入的内标质量，单位为纳克（ng）。
式中：
X——试样中维生素D2（或维生素D3）的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；
c——根据标准曲线得到的进样溶液中维生素D2（或维生素D3）的质量浓度，单位为微克每升（μg/L）；
V1——正相色谱净化时试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
V3——反相色谱测定时试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
100——由每克换算为每百克的换算系数；
m——试样的取样量，单位为克（g）；
V2——正相色谱净化时试样溶液取用体积，单位为毫升（mL）；
1 000——由μg/L换算为μg/mL的换算系数；
f——稀释因子。
计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
如试样中同时含有维生素D2和维生素D3，维生素D的测定结果以维生素D2和维生素D3的含量之和计算。
7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
8其他
当固体试样取样量为10.00 g，正相进样液定容2 mL时，维生素D2、维生素D3的检出限为0.6μg/100 g，定量限为2μg/100 g。
当液体试样取样量为50.00 g，正相进样液定容2 mL时，维生素D2、维生素D3的检出限为0.12μg/100 g，定量限为0.4 μg/100 g。
