GB 5009.296-2023 食品安全国家标准 食品中维生素D的测定 第二法

更新时间:2024-03-21      点击次数:298

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中华人民共和国国家标准

GB 5009.296-2023

食品安全国家标准 食品中维生素D的测定

第二法 在线柱切换-反相液相色谱法

 

9原理

  试样经氢氧化钾乙醇溶液皂化,液液萃取或固相萃取净化、浓缩后,一维液相色谱通过C8柱将维生素D与其他杂质分离后,由柱切换阀转入二维液相色谱中,通过C18柱分离维生素D2 和维生素D3,紫外检测器检测,内标法(或外标法)定量。当试样中不含维生素D2时,可用维生素D2作内标测定维生素D3;当试样中不含维生素D3时,可用维生素D3作内标测定维生素D2。否则,用外标法测定。

 

10试剂和材料

  除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

10.1 试剂

10.1.1无水乙醇(C2H6O):色谱纯。

10.1.2抗坏血酸(C6H8O6)。

10.1.3 26-二叔丁基对甲酚(C15H24O):简称BHT

10.1.4 a-淀粉酶(CAS号:9000-90-2,中温淀粉酶,来源于芽孢杆菌属):酶活力≥1.5 U/mg

10.1.5氢氧化钾 KOH)。

10.1.6正己烷(C6H14)。

10.1.7乙酸乙 酯(C4H8O2)。

10.1.8乙腈(C2H3N):色谱纯。

10.1.9甲醇(CH40):色谱纯。

10.2试剂配制

10.2.1氢氧化钾溶液(50%,质量分数):同3.2.1

10.2.2 BHT-乙醇溶液(0.2 g/100 mL):同3.2.2

10.2.3乙醇-水溶液(2 +3):将乙醇和水按23的体积比混合均匀。

10.2.4乙酸乙酯-正己烷溶液(3+2):将乙酸乙酯和正己烷按3 2的体积比混合均匀。

10.2.5乙腈-甲醇溶液(3+1):将乙腈和甲醇按31的体积比混合均匀,超声脱气。

10.2.6甲醇-水溶液(1+19):将甲醇和水按191的体积比混合均匀,超声脱气。

10.2.7乙腈-水溶液(19+1):将乙腈和水按191的体积比混合均匀,超声脱气。

10.3标准品

10.3.1维生素D2标准品:同3.3.1

10.3.2维生素D3标准品:同3.3.2

10.4 标准溶液配制

10.4.1维生素 D2标准储备溶液(1000 mg/L):同3.4.1

10.4.2维生素 D3标准储备溶液(1000 mg/L):同3.4.2

10.4.3维生素 D2标准溶液中间液(10.0 mg/L):同3.4.3

10.4.4维生素 D3标准溶液中间液(10.0 mg/L):同3.4.4

10.4.5维生素 D2标准使用溶液(1.00 mg/L):吸取10.00 mL维生素D2标准溶液中间液(10.0 mg/L)于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混匀。在-18℃是谁的下避光保存,保存期1个月。

10.4.6维生素 D3,标准使用溶液(1.00 mg/L): 吸取10.00 mL维生素D3标准溶液中间液(10.0 mg/L)于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混匀。在-18℃下避光保存,保存期1个月。

10.4.7标准系列工作溶液的配制

10.4.7.1当用维生素 D3作内标测定维生素D2时:分别吸取维生素D2标准使用溶液(1.00 mg/L0.25 mL0.50 mL1.00 mL2.00 mL5.00 mL10.00 mL100 mL棕色容量瓶中,各加入维生素D3内标使用液(1.00mg/L2.00mL,用初始流动相稀释至刻度,混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为2.5μg/L5.0μg/L10.0μg/L20μg/L50μg/L100μg/L,维生素D3内标质量浓度为20μg/L。临用前配制。

10.4.7.2当用维生素 D2作内标测定维生素D3时:分别吸取维生素D3标准使用溶液(1.00 mg/L0.25 mL0.50 mL1.00 mL2.00 mL5.00 mL10.00 mL100 mL棕色容量瓶中,各加入维生素D2内标使用液(1.00 mg/L2.00 mL,用初始流动相稀释至刻度,混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为2.5μg/L5.0μg/L10.0μg/L20μg/L50μg/L100μg/L,维生素D2内标质量浓度为20μg/L。临用前配制。

10.4.7.3当用外标法同时测定维生素D2和维生素D3时:分别吸取维生素D2标准使用溶液

1.00 mg/L)、维生素D3标准使用溶液(1.00 mg/L)各0.25 mL0.50 mL1.00 mL2.00 mL5.00 mL10.00mL100mL棕色容量瓶中,用初始流动相稀释至刻度,混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为2.5μg/L5.0μg/L10.0μg/L20μg/L50μg/L100μg/L。临用前配制。

10.5 材料

10.5.1固相萃取柱:以聚苯乙烯共聚物(PS-DVB)为基材的填料,6 mL200 mg,或相当者。

10.5.2微孔滤膜:有机系,孔径0.45 pm

 

11仪器和设备

11.1在线柱切换液相色谱系统,带紫外检测器。

11.2 天平,感量为0.1 mg0.001g0.01 g

11.13紫外分光光度计,带1cm石英比色皿。

11.4磁力搅拌器,带加热、控温功能。

11.5恒温振荡器。

11.6 多功能振荡器,带适用于50 mL离心管的适配器,转速>1 500 r/ min

11.7离心机,使用适用于50mL离心管的适配器,转速≥8000r/min

11.8 旋转蒸发仪。

11.9 氮吹浓缩仪。

11.10 超声波清洗器。

 

12分析步骤

12.1 样品前处理

  处理过程应避免紫外光照射。

12.1.1 试样制备

  将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品袋中,避光冷藏,尽快测定。

12.1.1.1婴幼儿配方食品 、特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料

  固体试样:按5.1.1.1制备试样溶液,称取制备后的溶液5gm3,精确至0.01 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中。按式(1)计算粉末样品质量(m)。

  液体试样:称取摇匀后的试样5 gm,精确至0.01 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中。

12.1.1.2谷物及其制品、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样

  称取均质后的试样5 g~10 gm,精确至0.01 g)至150 mL平底烧瓶中,加入约20 mL温水(40~45℃),置于磁力搅拌器中搅拌10min,混匀。婴幼儿谷类辅助食品参考5.1.1.1先制成浆液,再称取制备后的浆液20 g~50 gms,精确至0.01 g)至150 mL平底烧瓶中。

12.1.1.3 油脂及其制品、肉及肉制品、水产及其制品、蛋及蛋制品

  称取均质后的试样0.5 g~2 gm,精确至0.001 g)至50 mL带螺旋盖的离心管,加入3 mL~4.5 mL的温水(40~45℃),置于涡旋振荡器中振荡10 min,混匀。对于难均质的试样,可参考5.1.1.1先制成浆液,再称取制备后的溶液5 gm3,精确至0.01 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中。

12.1.1.4水果 蔬菜、豆类、食用菌、坚果和籽类

  称取均质后的试样5gm,精确至0.01 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中。干制品称取均质后的试样0.5 g~2 gm,精确至0.001 g)至50 mL带螺旋盖的离心管中,加入3 mL~4.5 mL的温水(40~45℃),置于涡旋振荡器中振荡10 min,混匀。

12.1.1.5 蜂蜡等黏稠胶质试样和其他食品

  称取均质后的试样2 g~20 gm,精确至0.01 g)至150 mL平底烧瓶中。

12.1.2 试样皂化

12.1.2.1婴幼儿配方食品 、特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料等试样

  12.1.1.112.1.1.312.1.1.4中描述的样品前处理方法称取适量试样于50 mL离心管中,加入100 μL内标使用溶液(1.00 mg/L,如测定维生素D2,用维生素D3作内标;如测定维生素D2,用维生素D2作内标) ,加入0.4 g抗坏血酸,6 mL BHT-乙醇溶液(0.2 g/100 mL),涡旋混匀30 s,再加入3 mL氢氧化钾溶液(50% ,质量分数) ,涡旋混匀后于恒温振荡器中皂化,温度80℃±2℃,时间30 min(或温度25℃±5℃,时间16 h±2 h),皂化后立即用冷水冷却至室温,加入5 mL乙醇-水溶液(2+ 3),混匀,待提取净化。

12.1.2.2谷物及其制品 、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样

  12.1.1.2中描述的150 mL平底烧瓶中,加入500 μL内标使用溶液(1.00 mg/L,如测定维生素D2 ,用维生素D3作内标;如测定维生素D3 ,用维生素D2作内标),加入1.0g a-淀粉酶,放入1颗磁力搅拌子,加上瓶塞,放入60℃磁力搅拌器中酶解30min,立即冷却至室温,向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液(0.2 g/100 mL),混匀。再加入10 mL~20 mL氢氧化钾溶液(50%,质量分数) ,边加边振摇,混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化,温度80℃±2℃,时间30 min(或温度25℃±5℃,时间16 h±2 h ,皂化后立即用冷水冷却至室温。用乙醇-水溶液(2+ 3)将皂化液转移至100 mL的容量瓶中,定容至刻度,摇匀,准确移取20 mL皂化液于50 mL的离心管中,待提取净化。

12.1.2.3含蜂蜡等黏稠胶质试样和其他食品

  12.1.1.5中描述的150 mL平底烧瓶中,加入500 μL内标使用溶液(1.00 mg/L,如测定维生素D2,用维生素D3作内标;如测定维生素D3,用维生素D2作内标) ,加入1.0 g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液(0.2 g/100 mL),放入1颗磁力搅拌子,将平底烧瓶置于磁力搅拌器中搅拌,混匀后加入约20 mL的温水(40~45℃),混匀,再加入10 mL~20 mL氢氧化钾溶液(50%,质量分数),边加边振摇,混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化,温度80℃±2℃,时间30 min(或温度25℃±5℃,时间16 h±2 h),皂化后立即用冷水冷却至室温。用乙醇水溶液(2 +3)将皂化液转移至100 mL的容量瓶中,定容至刻度,摇匀,准确移取20mL皂化液于50mL的离心管中,待提取净化。

  注:如用外标法,皂化条件选择温度25℃±5℃,皂化时间16 h±2 h

12.1.3试样提取净化

12.1.3.1液液萃取法

  于上述装有皂化液的离心管中加入5 mL水,混匀,加入20 mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液(3+2),振荡提取10 min8 000 r/min离心3 min,将上层溶液转移至另一50 mL的离心管中,于原离心管中再加入10 mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液(3+2),再次振荡提取10 min,高速离心机8000 r/min离心3 min,合并上层有机相于同一离心管中,加水至45 mL,振荡30 s8 000 r/min离心3 min,将上层有机相转移至旋蒸瓶中,于40℃旋蒸至约1 mL,用乙酸乙酯-正己烷混合溶液(3+2)转移至10 mL试管中,置于氮吹仪中吹至近干,用约4 mL乙腈-甲醇溶液(3+1)分3次溶解并转移至5 mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀,过0.45pμm微孔滤膜,供液相色谱测定。

  注:可根据实验室条件选择浓缩方式,氮吹仪或冷冻浓缩仪均可用于浓缩。最终定容体积可根据样品情况增减。

12.1.3.2固相萃取法

  固相萃取法适用于婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、调制乳(粉)、豆浆(粉)。

  于上述皂化液中加入0mL~15mL去离子水(使用不同品牌的固相萃取柱,去离子水的加量不同,需经验证后确定),涡旋混匀,8000r/min离心5min。全部上清液转移至固相萃取柱中(临用前依次用6 mL甲醇、6 mL水活化平衡)上样,过柱速度控制在不超过60/min。用10 mL甲醇-水溶液(1+19)洗涤离心管,涡旋30s8 000 r/min 离心5 min,将上清液一并转移到固相萃取柱上样,重复操作2次。上样完毕,负压抽干固相萃取柱,用8 mL乙腈-甲醇溶液(3+1)分3次洗脱,洗脱液加水定容至10mL,过0.45μm微孔滤膜,取滤液进样。

  注:如仪器灵敏度或进样体积受限,可将洗脱液氮吹至一定体积,再加水定容至适当体积,保持最终进样液中的溶剂体系为初始流动相体系。全自动在线固相萃取法可优化操作参数后使用。

12.2仪器参考条件

仪器参考条件如下:

a)一维色谱柱:C8柱,柱长150 mm,柱内径4.6 mm,粒径5μm,或相当者;

b)二维色谱柱:多环芳烃PAHC18柱长150 mm柱内径4.6 mm粒径3μm,或相当者;

c)柱温:35℃;

d)一维流动相:A相,水;B相,乙睛-甲醇(3+1,体积比);梯度洗脱:0 min~16 min 80%~100% B16 min~19 min100% B19.0 min~19.5 min100%~80% B;总运行时间30 min

e)二维流动相:A相,乙腈水溶液(19+1,体积比);B相,甲醇;95% A等度洗脱,总运行时间30 min

f)流动相流速:一维流速,1.0 mL/ min;二维流速,0.4 mL/ min

g)波长:264 nm

h)进样量:100 μL

i)根据维生素D在一维色谱柱上的保留时间确定六通阀切换时间:0.00 min~10.95 min,阀状态110.95 min~11.45 min,阀状态211.45 min~ 30 min,回到阀状态1,在线柱切换流路图见附录C

j)富集柱:C18柱,柱长 5 mm,柱内径4.6 mm,粒径4μm,或相当者。

12.3标准曲线的制作

  将标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中,以标准系列工作溶液中维生素D2(或维生素D3)的浓度为横坐标,以维生素D2(或维生素D3)的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。维生素D2和维生素D3标准溶液的一维色谱图参见图B.2,二维色谱图参见图B.3

12.4试样溶液的测定

12.4.1定性分析

  将试样溶液注入液相色谱仪中,同样测试条件下,试样溶液中维生素D2、维生素D3的保留时间与标准工作溶液中相应的保留时间相比,偏差应在±2.5%以内。

12.4.2定量测定

  将试样溶液注入高效液相色谱仪中,得到维生素D2(或维生素D3)的峰面积,根据标准曲线得到待测液中维生素D2(或维生素D3)的浓度。待测试样溶液中的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围,可以适当减少取样量重新测定。

12.5空白试验

  不称取试样,按样品分析步骤操作,应不含有干扰待测组分的物质。内标法需要做不加内标的样品试验,确认加入内标的可行性。

 

13分析结果的表述

试样中维生素D2(或维生素D3)的含量,内标法按式(2)和式(3)计算,外标法按式(5)计算。

                                              image.png

式中:

X——试样中维生素D2(或维生素D3)的含量,单位为微克每百克(μg/100 g);

c——根据标准曲线得到的进样溶液中维生素D2(或维生素D3)的质量浓度,单位为微克每升;

V——进样溶液定容体积,单位为毫升(mL);

100——由每克换算为每百克的换算系数;

n——试样的取样量,单位为克(g);

1 000——由μg/L换算为μg/mL的换算系数;

f——稀释因子。

  计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留3位有效数字。

  如试样中同时含有维生素D2和维生素D3 ,维生素D的测定结果以维生素D2和维生素D3的含量之和计算。

 

14 精密度

  在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%

 

15其他

  当固体试样取样量为0.50 g,定容5.00 mL时,维生素D2、维生素D3的检出限为0.6 μg/100 g,定量限为2 μg/100 g

  当液体试样取样量为5.00 g时,定容5.00 mL时,维生素D2、维生素D3的检出限为0.06 μg/100 g,定量限为0.2 μg/100 g


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