中华人民共和国国家标准
GB/T 33309-2016
化妆品中维生素B6（吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛 5-磷酸酯）的测定 高效液相色谱法
Determination of vitamin B6（pyridoxine，pyridoxine hydrochloride，
pyridoxine fatty acid esters and pyridoxal 5-phosphate） in cosmetics-
High performance liquid chromatography
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国轻工业联合会提出。
本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会（SAC/TC 257）归口。
本标准起草单位：山东省产品质量监督检验研究院、聊城大学、山东省食品药品检验研究院、上海市日用化学工业研究所。
本标准主要起草人：霍艳敏、王骏、张娟、张卉、周莉莉、段文增、邹惠玲、王艳丽、薛霞、宿书芳、刘艳明、崔玉花、刘桂亮、张艳侠、沈敏。
1范围
本标准规定了化妆品中维生素B6（吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯）的高效液相色谱测定方法。
本标准适用于膏霜、乳液、液体类等化妆品中吡哆索、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯的测定。
本标准方法检出限为：吡哆醛1.0 mg/kg、吡哆素0.3 mg/kg，定量限为：吡哆醛2.5 mg/kg、吡哆素1.2 mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
本标准通过酶解、皂化反应将样品中的维生素B6均转化为吡哆素或吡哆醛的形式，利用高效液相色谱配荧光检测器进行分离及分析，保留时间定性，外标法定量测定维生素B6的含量。
4试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1甲醇：色谱纯。
4.2七氟丁酸：色谱纯。
4.3碱性磷酸酶：酶活力不小于10 U/mg。
4.4 磷酸：优级纯。
4.5 氨水：优级纯，含量为25%~28%。
4.6 磷酸二氢铵：优级纯。
4.7 磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）。
4.8乙醇。
4.9盐酸。
4.10氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250 g，加入200 mL水溶解。
4.11 30%磷酸水溶液（体积分数）：准确量取30mL磷酸（4.4）和70mL水，混匀后备用。
4.12 30%氨水溶液（体积分数）：准确量取30 mL氨水（4.5）和70 mL水，混匀后备用。
4.13盐酸溶液（5.0 mol/L，0.1 mol/L）：量取40 mL、0.8 mL盐酸（4.9）分别放入两个100 mL容量瓶中，用水定容，分别得5.0 mol/L、0.1 mol/L盐酸溶液。
4.14氢氧化钠溶液（5.0 mol/L，0.1 mol/L）：称取20 g、0.4 g氢氧化钠用水溶解，分别放入两个100 mL容量瓶中，用水定容，分别得5.0 mol/L、0.1 mol/L氢氧化钠溶液。
4.15离子对试剂绶冲溶液[0.02 mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液（含0.001 mol/L七氟丁酸）]：称取2.30 g磷酸二氢铵，加入约980 mL水溶解，用30%磷酸（4.11）或30%氨水（4.12）调节pH值至4.5，加入170 μL七氟丁酸（4.2） ，用水定容至1 L备用。
4.16磷酸氢二钠溶液（0.1 mol/L）：称取17.8 g磷酸氢二钠（4.7），用水溶解，定容至1 000 mL，用氢氧化钠溶液（4.14）调节pH值至9.8，备用。
4.17碱性磷酸酶溶液（1.0 g/L）：称取50 mg碱性磷酸酶，用水定容至50 mL。临用前配制。
4.18标准样品：吡哆索和吡哆醛，纯度不小于99.0%。维生素B6（吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯和吡哆醛5-磷酸酯）的CAS号、分子式、相对分子质量、化学结构式参见附录A。
4.19维生素B6（吡哆素、吡哆醛）标准贮备液（1 mg/mL）： 准确称取0.025 g（精确至0.000 1 g）吡哆素、吡哆醛标准品，分别置于25mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存，有效期3个月。
4.20维生素B6（吡哆素、吡哆醛）混合标准中间液1（100 μg/mL）、混合标准中间液2（10 μg/mL）：分别准确吸取维生素B6标准贮备液（4.19）5 mL、0.5 mL至50 mL容量瓶中，用水溶解、定容，混匀。
4.21维生素B6（吡哆素、吡哆醛）混合标准系列工作液：分别准确吸取维生素B6混合标准中间液2（4.20）0.1 mL.1.0 mL，混合标准中间液1（4.20）1.0 mL、5.0 mL、10.0 mL、20.0 mL至100 mL容量瓶中，用水溶解定容。该标准系列浓度分别为0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/ mL、10.0 μg/ mL、20.0μg/mL。临用前配制。
4.22微孔滤膜：0.45 μm，有机相。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱（HPLC）仪：配有荧光检测器。
5.2 分析天平：感量为0.000 1 g和0.01 g。
5.3涡旋混合器。
5.4 水浴振荡器。
5.5 pH计。
5.6具塞塑料离心管：50 mL.
6分析步骤
6.1 试样处理
6.1.1试样标签中标注含吡哆醛5-磷酸酯的试样
称取1.0 g混合均匀试样（精确至0.000 1 g）置于50 mL具塞塑料离心管（5.6）中，加入1.0 mL碱性磷{酸酶溶液（4.17）、用磷酸氢二钠溶液（4.16）定容至10.0 mL，用涡旋混合器（5.3）充分混匀，置于水浴振荡器（5.4）上，于（37±1）℃振荡酶解12 h以上。
6.1.2试样标签中标注含吡哆素、盐酸吡哆素及吡哆素脂肪酸酯的试样
称取1.0 g混合均匀试样（精确至0.000 1 g）置于50 mL具塞塑料离心管（5.6）中，加入10.0 mL水，用涡旋混合器（5.3）充分混匀。
6.2待测液的制备
于上述处理的试样溶液（6.1.1或6.1.2）中加入20.0 mL乙醇，充分混匀后加入1.0 mL氢氧化钾溶液（4.10）混匀，置于水浴振荡器（5.4）上，于45℃±2℃避光振荡皂化45 min。皂化完成后，取出冷却至室温，加入1.05 mL盐酸（4.9），用盐酸溶液（4.13）或氢氧化钠溶液（4.14）调节试样pH值至7.0，将试样转移至50.0 mL容量瓶中，用水定容至50.0 mL（V1），混匀，静置。准确移取5.0 mL （V2）上层清液于25.0 mL容量瓶中，用水定容至25.0 mL （V3），混匀，上清液过微孔滤膜（4.22）后，供HPLC测定。
6.3 测定
6.3.1参考条件
高效液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C18柱，250 mmX4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者。
b）流动相：溶剂A：甲醇，溶剂B：离子对试剂缓冲溶液（4.15）。
c）流速：1.0 mL/min。
d）检测波长：激发波长 293 nm，发射波长395 nm。
e）柱温：35℃。
f）进样量：10 μL。
g）梯度洗脱条件见表1。
6.3.2标准工作曲线绘制
系列标准工作液（4.21）按色谱条件（6.3.1）进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，对应的溶液浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。吡哆醛、吡哆索标准样品色谱图参见附录B。
6.3.3 试样测定
试样溶液（6.2）按色谱条件（6.3.1）进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，由色谱峰的峰面积从标准曲线上求出相应的吡哆醛、吡哆素的浓度。样品溶液中被测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，超过线性范围的应稀释后再进样分析。
6.4 空白试验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
7结果计算
试样中吡哆醛或吡哆素的含量按式（1）计算：
式中：
Xi——试样中被测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
Ci——从标准曲线上得到的待测液中维生素B，各组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V1——样品提取液总体积，单位为毫升（mL）；
V2——稀释用样品体积，单位为毫升（mL）；
V3——稀释液体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）。
计算结果需扣除空白值，保留至小数点后-位。
注：试样中盐酸吡哆素及吡哆素脂肪酸酯以吡哆素计，吡哆醛5-磷酸酯以吡哆醛计。
8回收率
吡哆素和吡哆醛分别在添加浓度1.2mg/kg~20000mg/kg和2.5mg/kg~20000mg/kg浓度范
围内，回收率在91.6%~108.1%之间，相对标准偏差小于10%。
9允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
