Spherisorb色谱柱连接到HPLC系统的注意事项
A.色谱柱接头和系统管路注意事项
所有Spherisorb色谱柱都配备沃特世末端接头。
Spherisorb分析柱所需的工具：
1/2英寸扳手
9/16英寸扳手
Spherisorb小柱所需的工具：
1/4英寸扳手
小心拿取色谱柱。切勿让色谱柱掉落或撞击到坚硬表面，因为这样会扰乱柱床并且影响色谱柱性能。
1. 正确连接接入和接出色谱柱的1/16英寸外径不锈钢管路对于获得高质量色谱结果至关重要。
2. 使用标准不锈钢压力螺母接头时，确保其正确匹配1/16英寸外径不锈钢管路非常重要。拧紧或拧松压力螺母时，将5/16英寸扳手置于压力螺母上，并将1/2英寸扳手置于色谱柱末端接头的六角头上。
注：在这个过程中，如果任一扳手未正确放在色谱柱管路的搭扳手平面上，都会导致末端接头松动渗漏。
3. 如果在不锈钢压力螺母接头和色谱柱末端接头之间出现渗漏，必须组装新的压力螺母接头、管路和锥箍。
4. 色谱柱识别标签上的箭头指示了正确的溶剂流向。正确连接接入和接出色谱柱的1/16英寸外径不锈钢管路对于获得高质量色谱结果至关重要。本应成功的分离可能因色谱柱发生额外峰展宽而失败，认识到这一点非常重要。下文详细介绍了如何选择合适的色谱柱接头和系统管路。由于缺乏行业标准，不同色谱柱制造商使用了不同类型的色谱柱接头。如果色谱柱末端接头的类型与现有的管路接头设置不匹配，可能对色谱分离性能产生负面影响。下文将解释沃特世和Parker的锥箍及末端接头之间的差别(图1)。不同类型的末端接头要求管路伸出锥箍的长度不尽相同。Spherisorb色谱柱配备的沃特世末端接头要求管路伸出锥箍0.130英寸。如果您目前使用的是Parker色谱柱，则在安装Spherisorb色谱柱前必须重置锥箍深度以获得理想性能。
管路/色谱柱连接正确时(图2)，管路应接触到色谱柱末端接头的底部，二者之间不应有死体积。
流路中存在死体积会影响色谱柱性能。如果将Parker锥箍连接至沃特世末端接头，就可能出现这种情况(图3)。
注：如果将装有Parker锥箍的管路连接到沃特世色谱柱上，会出现死体积。
只有一种方法可以解决这个问题：切断装有锥箍的管路末端，在管路上安装新的锥箍并重新连接。在拧紧螺母前,请确保管路接触到色谱柱末端接头的底部。相反，如果是将装有沃特世锥箍的管路连接到带Parker末端接头的色谱柱,则管路末端在锥箍到达合适的密封位置之前就会接触到底部。这会留下空隙并造成渗漏(图4)。
注：如果将沃特世锥箍连接到装有Parker末端接头的色谱柱上，会导致渗漏。
有两种方法可以解决这个问题：
1. 进一步拧紧螺母。这样锥箍会向前移动并到达密封表面。切勿过度拧紧，因为这样可能会损坏螺母。
2. 切断管路，更换锥箍并重新连接。
B. 尽可能减小谱带展宽
图5显示了管路内径对系统谱带展宽以及峰形的影响。由图可见，管路内径较大会引起峰展宽和灵敏度降低。
典型HPLC系统的谱带展宽体积应为100 μL ± 30 μL(或方差为400 μL2 +/- 36 μL2)。微内径(内径2.1 mm)系统的谱带展宽体积不应超过20~40 μL(或方差不超过16 μL2~64 μL2)。
C. 测量系统体积
系统体积对于放大分离非常重要，因为它会在每次运行开始时产生一段等度保持。在小规模分离中，这段等度保持通常是数倍色谱柱体积，但对于制备型分离，等度保持可能只占制备级色谱柱体积的一部分。设计放大实验时必须考虑补偿该体积，以避免色谱峰畸变(图7)。
1. 取下色谱柱。
2. 使用乙腈作为流动相A，含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈作为流动相B(消除无添加剂混合和粘度问题)。
3. 将UV检测器波长设置为254 nm。
4. 在目标仪器上运行初始方法的流速和预期流速。
5. 采集运行100%流动相A时的基线5 min。
6. 将梯级设置为5 min后变为100%流动相B，然后继续采集数据5 min。
7. 测量100%流动相A和100%流动相B之间的吸光度差值。
8. 测定该吸光度差值的50%处的时间。
9. 计算梯度起点与50%点之间的时间差值。
10. 将时间差值乘以流速。
